第３８卷第２期 ２ ０ ｌ １年Ｏ３月 酿 酒 ＭＡＫＩＮＧ Ｖ０１．３８．№．２ Ｍ８１＂．，２０１ｌ ＬＩＱＵＯＲ 文章编号：１００２—８１ｌｏ（２０１１）０２一Ｏ０４４—０３ 产酯酵母和耐高温酵母原生质体形成与再生条件研究★ 方尚玲１，刘源才 ，郭圣祥 ，李锐利 ，陈茂彬 （１．发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北２．劲牌有限公司，湖北大冶４３５１００） 武汉４３００６８； 摘要：选取脱壁预处理时间、蜗牛酶浓度、酶解时间三因素设计三因素三水平正交试验来研究产酯酵母和耐 高温酵母原生质体形成与再生条件。结果表明，产酯酵母原生质体形成与再生最佳条件为：预处理２０ｍｉｎ、１％ 蜗牛酶酶解３０ｍｉｎ；耐高温酵母为：预处理１０ｍｉｎ，１．５％蜗牛酶酶解６０ｍｉｎ。 关键词：产酯酵母；耐高温酵母；原生质体形成与再生；正交试验 中图分类号：ＴＳ２６１．１１；ＴＳ２６１．１５；Ｑ９３３ 文献标识码：Ｂ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｙｅａｓｔ ＦＡＮＧ Ｓｈａｎｇ—ｌｉｎＩ，ＬＩＵ Ｙｕａｎ—ｃａｉ２，ＧＵＯ Ｓｈｅｎｇ—ｘｉａｎｇ￣．ＬＩ Ｒｕｉ—ｌｉ１，ＣＨＥＮ Ｍａｏｂｉｎ “ ｆ１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ），Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００６８，Ｃｈｉｎａ； ２．ｊｉｎｇ Ｂｒａｎｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｄａｙｅ，Ｈｕｂｅｉ ４３５１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｆａｃｔｏｒｓ（ｉｎｅｌｕｄｅｉｎｇ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｔｍｅ，ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａ—ｔｉｏｎ，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ）ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｔＯ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌｓｔａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅ ｅｓｕｌｒｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｓｔｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｗａｓ ２０ ｍｉｎｕｔｅｓ， ｓｎａｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ １％．ｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３０ ｍｉｎｕｔｅｓ；ｆｏｒ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒ—ａｎｔ ｙｅａｓｔ ｗｅｒｅ ｔｈａｔ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｗａｓ １０ ｍｉｎｕｔｅｓ，ｓｎａｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ １．５％．ｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｗａｓ ６０ ｍｉｎｕｔｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｓｔｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ；ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｙｅａｓｔ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ 产酯酵母是白酒生香重要的微生物菌群，添加适量的产 酯酵母，对增加白酒的风味成分，保证和稳定酒质十分重要 ｉｌｌ。而且运用原生质体融合选育耐高温酵母已有诸多报道［３－５１，证 明以上设想是完全可行的。本文旨在对产酯酵母和耐高温酵 母原生质体形成与再生条件进行研究，为之后的融合育种打 下基础。因为原生质体的形成与再生是融合的基础与前提，能 白酒发酵过程中，品温一般会升高至３８～４０￣Ｃｔ２１，但是，目前 使用的产酯酵母多是从自然界分离筛选出来的野生型菌株， 存在着耐温性能较差等缺点，因此就了产酯酵母的应用。 本研究从酿酒用曲中分离得到一株产乙酸乙酯量高的产 酯酵母和一株耐高温酵母，该产酯酵母产乙酸乙酯量高，但在 ３８℃就不能生长。耐高温酵母产酯能力弱，５０％仍然生长良好。 够获得较高的原生质体形成率和再生率，是保证融合育种效 率的首要条件 。 １ 材料与方法 １．１ 材料 如果能够通过原生质体融合，选育出具有一定耐温能力，适合 白酒生产条件的产酯酵母，将大大提升产酯酵母的应用前景。 基金项目：国家自然科学基金项目《３１０７１５９４）：湖北省自然科学基 金（２００８ＣＤＢ０６３）；２００９年博士科研启动基金ＢＳＱＤ０９１０；发酵工 １．１．１菌株 产酯酵母、耐高温酵母：分离自白酒酿造用曲 １．１．２培养基 液体ＹＥＰＤ培养基：葡萄糖２％，酵母膏１％，蛋白胨２％； 固体ＹＥＰＤ培养基：葡萄糖２％，酵母膏１％，蛋白胨２％，琼脂 １％；高渗再生ＹＥＰＤ培养基：固体完全培养基（ＹＡＰＤ）中加入 ０．６ｍｏｌ／Ｌ蔗糖。 １．１．３试剂 程省部共建教育部重点实验窒开放基金（２００９ＫＦＪＪＯ１】 收稿日期：２０１卜０卜１８ 作者简介：方尚玲，女，湖北蕲春，博士，副教授，主要研究方向：工业 微生物。 ”通讯作者：陈茂彬，男，博士，教授，主要研究方向：酿酒技术。 ｐＨ６．０柠檬酸—磷酸缓冲液 ；渗透压稳定剂：０．８ｍｏｌ／Ｌ 第二期 方尚玲，等：产酯酵母和耐高温酵母原生质体形成与再生条件研究 ２０１１ ＫＣ１，用柠檬酸一磷酸缓冲液配制；酶液：１．０％、１．５％、２．Ｏ％蜗 牛酶，用渗透压稳定剂配制，０．４５ｕｍ微孑Ｌ滤膜过滤除菌；脱壁 预处理剂：１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ ，５０ｍｍｏ１］Ｌ二硫苏糖醇（ＤＤＴ），用 渗透压稳定剂配制。 １．１．４仪器设备 ＺＨＪＨ—Ｃ１２１４Ｂ超净工作台：上海智诚分析仪器制造有限 公司；ＺＨＷＹ一２１０２Ｃ恒温摇床培养箱：上海智诚分析仪器制 造有限公司；ＰＨＸ智能生化培养箱：宁波莱福科技有限公司； ＷＦＳ２０００可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司； ＴＧＬ－１６Ｃ台式离心机：上海安亭科学仪器厂；ＨＨ一６数显恒温 水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；ＸＳＰ一８ＣＥ显 微镜：上海蔡康光学仪器有限公司；ＴＫ—Ｃ１２０１ＥＣ彩色摄像 机：北京杰伟世视音频设备有限公司；ＢＣＤ一２２６冰箱：博西华 家用电器有限公司。 １．２方法 一目ｃｏ９ 一 ００ １．２．１酵母菌生长曲线的绘制［Ｍ ８１ ｍ ６ ４ ２ 将待测菌株接种于ＹＥＰＤ液体培养基中，３０ 活化 ２４ｈ，再转接于５０ｍＬ ＹＥＰＤ液体培养基中，同时做３个平行 样和一个空白对照，用分光光度计每隔２ｈ测量一次培养液 ＯＤ值（６００ｎｍ）。以培养时间为横坐标，ＯＤ值为纵坐标，绘制生 长曲线。 １．２．２酵母菌原生质体形成与再生条件正交试验 １．２．２．１酵母菌原生质备［９１ 将两株酵母菌株在液体ＹＥＰＤ培养基中３０℃活化２４ｈ。 将活化后的酵母菌分别接种于装有５０ｍｌＹＥＰＤ的１５０ｍＬ三 角瓶中，３０℃振荡培养至对数生长前期。将上述培养液 ３５００ｒ／ｍｉｎ离心收集菌体，用无菌水离心洗涤两次，尽可能除 去杂质。将酵母细胞分别悬浮于３ｍｌ脱壁预处理溶液中，３０℃ 振荡处理，之后３５００ｒ／ｍｉｎ离心收集菌体。将菌体悬浮于３ｍＬ 的蜗牛酶液中，３Ｏ℃振荡培养，酶解一段时间可取样用显微镜 观察细胞形成原生质体情况。到达酶解时间之后，５０００ｒ／ｍｉｎ 离心收集原生质体细胞，用渗透压稳定剂洗涤离心２次，之后 将原生质体细胞悬浮于渗透压稳定剂中。 Ｉ．２．２．２酵母菌原生质体形成与再生条件正交试验 选取脱壁预处理时间、蜗牛酶浓度、酶解时间ｊ个因素， 设计三因素三水平正交试验来探讨Ｙ１酵母菌原生质体形成 与再生的最佳条件。因素水平表见表１。 表１正交试验因素水平表 １．２３原生质体形成率与再生率的计算ｆ ０１ ２结果与分析 ２．１ 产酯酵母与耐高温酵母的生长曲线，见图１ ０ ２ ４ ６ ８ ｌ０ １２ １４ ｌ６ ｌ８ ２０ ２２ ２４ ２ 生长时间／ 图１ 两株酵母菌的生长曲线 由图１可知，产酯酵母的生长特征是：前６ｈ为延滞期 ６～１２ｈ为对数生长，１２ｈ后菌体生长趋于稳定。而耐高温酵 的生长特征是：前４ｈ为延滞期，４～ｌＯｈ为对数生长，ｌＯｈ后 体生长趋于稳定。为了使菌体细胞易于原生质化，一般选择ｊｃ 数生长期的菌体。这时的细胞正在生长，代谢旺盛，生长率高 群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致。细胞壁对 解作用最为敏感。此时的原生质体形成率高，且再生率高…】 而且，利用对数生长期的单倍体酵母细胞来制备原生质体 行融合，能够有效地降低重组体（融合子）回复突变率旧。所Ｅ 本实验收集生长８ｈ的产酯酵母和生长６ｈ的耐高温酵母菌和 来进行原生质体形成与再生条件的研究。 ２．２．２酵母菌原生质体形成与再生条件研究 ２．２．２．１酵母菌原生质备 产酯酵母与耐高温酵母细胞酶解前与酶解后的对比显磺 照片，见图２（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。 ａ产酯酵母酶解前细胞形态 ｂ产酯酵母酶解后细胞形态 ｃ耐高温酵母酶解前细胞形态ｄ耐高温酵母酶解后细胞形态 图２产酯酵母与耐高温酵母细胞酶解前与酶解后的对比显微照片 １９５８年，Ｂｒｅｎｎｅｒ等人提出了细菌原生质体的３条标准 濑 第二期 西良 酒 ２０１１ 没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感。所以菌株 细胞壁溶解后，原生质体即以球状体的形态开始释放Ｉ 。由图 ２（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）可知，酵母细胞酶解前的细胞形态大多数是椭圆， 也说明，菌株的原生质体形成与再生因不同菌株细胞生理和 结构的不同而存在差异。 ３结论 而酶解后细胞都变成圆形，据此可以判断原生质体已经形成。 ２．２．２．２酵母菌原生质体形成与再生正交试验结果 原生质体的形成与再生与很多因素有关，如菌龄、酶浓 度、酶解时间、预处理、原生质备时稳定剂的种类等都有 关联。原生质体再生与菌体本身特性有关外，还与制备的条件 产酯酵母原生质体形成与再生正交试验结果见表２，耐 高温酵母原生质体形成与再生正交试验结果见表３。 表２产酯酵母原生质体形成与再生正交试验结果 表３耐高温酵母原生质体形成与再生正交试验结果 当采用正交试验研究原生质体形成与再生条件时，一般 都以形成率与再生率乘积作为指标来衡量原生质体形成与再 生的最佳条件１１４－Ｉ￣Ｉ。因此，由表２和表３可知，产酯酵母的原 生质体形成与再生的最优条件组合为Ａ Ｂ。ｃ 即预处理 ２０ｍｉｎ、１％的蜗牛酶酶解３０ｍｉｎ。耐高温酵母的为Ａ Ｂ２Ｃ：，即预 处理ｌＯｍｉｎ、１．５％的蜗牛酶酶解６０ｍｉｎ。在相同的形成与再生 条件下，产酯酵母的形成率与再生率都要高于耐高温酵母，这 和再生培养基等外在因素密切相关，尤其是原生质备时 的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大 。因此，本 文选取预处理时间，酶浓度、酶解时间三个因素来研究产酯酵 母与耐高温酵母的原生质体形成与再生条件，得到两株酵母 菌原生质体形成与再生的最佳条件分别为：产酯酵母预处理 ２０ｍｉｎ，１％的蜗牛酶酶解３０ｍｉｎ，原生质体形成率达８９．７％，再 生率为１９．３％；耐高温酵母预处理ｌＯｍｉｎ，１．５％的蜗牛酶酶解 ６０ｍｉｎ，原生质体形成率达７７．５％，再生率为７．７％ 【参考文献ｌ 【１】赵华，赵树欣，张维，等．耐温型产酯酵母的选育【Ｊ】．酿酒，１９９７，１２０ （３）：１７－１９ 【２】康明官．清香型白酒生产技术［ＭＩ．北京，化学工业出版社，２００５．３ ［３】蒋岳，路福平，王敏，等．原生质体电诱导融合构建高温酿酒酵母【Ｊ】． 微生物学杂志，２００２，２２（３）：５９—６０，６２． 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