浙江中医杂志２０１７年８月第５２卷第８期 滋肾育胎丸对肾阳虚型多囊卵巢综合征模型小鼠 血清抑制素Ｂ及干细胞因子的影响 邢佳 傅萍 陈婷婷 １ 浙江省杭州市中医院 浙江杭州３１０００７ ２ 浙江中医药大学第三临床医学院 浙江杭州３１００５３ 关键词 滋肾育胎丸 肾阳虚型 多囊卵巢综合征抑制素Ｂ干细胞因子 ． 多囊卵巢综合征（ＰＣＯＳ）是妇科常见的一种生殖功 胎丸低剂量组、滋肾育胎丸中剂量组、滋肾育胎丸高剂 能障碍和代谢紊乱性疾病，其关键病理机制为卵泡发育 量组、达英一３５组，每组各９只，全程喂以普通饲料。 异常和排卵障碍。近年来研究发现“ ，抑制素Ｂ（ＩＮＨＢ）、 １．４方法：分述如下。 干细胞因子（ＳＣＦ）与卵泡发育及排卵密切相关。本实验 １．４．１动物模型的建立：采用脱氢表雄酮联合氢化可 以ＩＮＨＢ、ＳＣＦ为切人点，用ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值衡量小鼠模型 的松法诱导肾阳虚型ＰＣＯＳ小鼠模型。模型组、滋肾育胎 的阴阳偏向，通过观察滋肾育胎丸对肾阳虚型ＰＣＯＳ模 丸低剂量组、滋肾育胎丸中剂量组、滋肾育胎丸高剂量 型小鼠血清中ＩＮＨＢ、ＳＣＦ表达的影响，探讨滋肾育胎丸 组、达英一３５组每日予颈背部皮下注射９ｍｇ／ｌＯＯｇ ＤＨＥＡ 的治疗机制，为临床运用中医药诊治肾阳虚型ＰＣＯＳ提 油溶液０．１ｍｌ，２６日后，加用氢化可的松２５ｍｇ／ｋｇ体重后 供实验依据。 肢肌肉注射，日１次，连续１４日；空白组每日予颈背部皮 １材料与方法 下注射注射用大豆油０．１ｍｌ，２６日后，加用等体积生理 １．１实验动物：２１日龄雌性ＩＣＲ小鼠，５４只，ＳＰ．Ｆ 级；浙盐水后肢肌肉注射，日１次，连续１４日。 江中医药大学动物实验中心提供。将小鼠置于浙江中医 １．４．２预防性治疗：滋肾育胎丸低、中、高剂量组全程 药大学动物实验中心内饲喂。实验期间同一室内笼养， 分别予滋肾育胎丸１．１３ｇ／ｋｇ、４．５０ｇ／ｋｇ、２．２５ｇ／ｋｇ灌 室温１８ ２２￣Ｃ，１２ｈ光照，１２ｈ黑暗，自由饮水，饲料由浙 胃，共４０天；达英一３５组全程予达英一３５蒸馏水混悬液 江中医药大学动物实验中心提供。 ０．３ｍｇ／ｋｇ灌胃，共４Ｏ天；空白组、模型组予等体积生理 １．２ 药物与试剂：滋肾育胎丸（６０ｇ装），购自广州白云 盐水灌胃。 山中一药业有限公司；达英一３５，由Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＧｍｂＨ＆ １．４．３标本采集：末次给药后ｌ２小时，对小鼠行颈椎 Ｃｏ．Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎｓ ＫＧ提供，每粒含２ｍｇ醋酸环丙孕酮和 脱臼法处死并采集标本。 ０．０３５ｍｇ炔雌醇，使用时加蒸馏水制成０．３ｍｇ／ｋｇ混悬 １．５观察指标：①实验开始后每３天观察一次小鼠一 液；脱氢表雄酮（ＤＨＥＡ）粉剂，购自美国ｓｉｇｍａ公司；注射 般状态（活动度、被毛颜色及光泽度等）；②从２８日龄起 用大豆油（用于溶解ＤＨＥＡ），购自九三集团海尔滨众和 小鼠阴门开放后每日行阴道涂片观察脱落细胞改变直 商贸有限公司；氢化可的松注射液，购自天津金耀药业 到实验结束；③酶联免疫吸附法（Ｅ１ｉｓａ）测定血清黄体 有限公司；所有小鼠Ｅ１ｉｓａ试剂盒均由杭州昊鑫生物科 生成素（ＬＨ）、卵泡刺激素（ＦＳＨ）、睾酮（Ｔ）、雌二醇（Ｅ２）、 技股份有限公司提供。 环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）、环磷酸鸟苷（ｃＧＭＰ）、抑制素Ｂ（ＩＮ－ １．３分组与饲养：适应性喂养２日后，将２１日龄雌性 ＨＢ）、干细胞因子（ＳＣＦ）水平。④对所取卵巢进行病理切 ＩＣＲ小鼠随机分为６组，分别设空白组、模型组、滋肾育 片，在光学显微镜下观察其组织形态学改变。 １．６统计学方法：采用ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １９．０软 件对测定数据进行统计分析。全部计量资料以均数±标 ：Ｉｃ基金项目：广东省罗元恺滋肾育胎丸中青年科研基金项 目滋肾育胎丸对肾虚型ＰＣＯＳ模型小鼠ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、ＡＭＨ、ＩＮＨＢ、 准差（ ±ｓ）表示，进行方差分析或ｔ检验。两组计量资料 ＳＣＦ影响的研究，编号：ＨＸ２０１５０２—１４０２０３；国家中医药管理局 问比较采用ｔ检验；多组间比较采用方差分析，首先行 傅萍全国名老中医药专家传承工作室建设项目，编号：国中医 方差齐性检验，若方差齐性，则选用ＬＳＤ或ＳＮＫ法，若方 药人教发［２０１４￣２０号；浙江省傅萍名老中医专家传承工作室 差不齐，则选用Ｔａｍｈａｎｅ’Ｓ Ｔ２或Ｄｕｎｎｅｔｔ’Ｓ Ｔ３法。双侧 研究项目，编号：ＧＺＳ２０１２０２３ 检验，以Ｐ＜０．０５为有统计学意义。 ＃通讯作者：傅萍，Ｅ－ｍａｉ１：ｆｕｐｉｎｇｓｓ＠１６３．ａｏｍ ２结果 浙 Ｉ｝ 朵 ２０１ ７年８』ｊ第５２卷第８期 ・ ５７７ ・ ２．１ 各组小鼠一般状态的变化： ｈ组小鼠喜动活跃， 动作敏捷，大便』ｌ 常，己色）匕泽，肢尾温暖，睡眠时间 ５天为１个ｌ ｜』Ｊ情ⅧｊＪｃ】， Ｉ 脱动情 动情Ｊ州ｌ９Ｊ 、动 ｈｌｊ＝ 、动 ｌ＇ｉｆＪ 、动情 １９Ｊ ４个 ｊ Ｊ规 …脱模 胞持续，『】化， 个火上Ｉ ＩＪ、鼠Ｈ兑 细 治疗 小 常．．模 组小鼠精神萎愫，反应迟钝，夫便稀溏．群聚蜷 缩，活动减少，（：色黯淡，肢尾冷，睡眠时问延长 各治疗 ￣ＩＰＪ，鼠造模成功 表脱… ＿ｊ模型组相似的阳虚症状，随 －观察卡』Ｊ Ｊ／Ｉ．￣落细胞土 ＆脱为尤仫们化乡ｆ¨Ｊ】乜 少 Ｉ 皮细胞，火 Ｉ 动．ｈＩｊ ！＝』『Ｊ，随符川约Ｈ、ｒ川的延Ｋ，部分 小鼠动川ｈ 州ｌｆＪ】逐渐恢 Ｉ㈠ ２．３ 各组小鼠血清性激素水平、（－ＡⅧ，／（ （ 比值的政 变： １、 ２ 着用药时间的延Ｋ，部分小鼠精神状态较前好转，活动 增加，被巴比洋恢复，大便成彤 ２．２各组小鼠阴道脱落细胞的变化： ｈ组小鼠以４ 表１各组小鼠血清性激素水平的变化（．ｒ± ，ｎ＝９） ： Ｉ ｌ比较，★Ｐ ０．０５； ｊ模型组比较，▲Ｐ＜０．０５ 表２各组小鼠血清ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值 的变化（ ± 。ｎｍｏ］／１ Ｆ９） 印泡１人Ｊ哪 胞及放射，脱－－洲－，Ｉ，人． 胞Ｊ 变薄Ｉｉ‘排州 疏松，膜纠ＩＩ胞小 ！Ｊ！ＪＩ增，ｆｉ、排列久 齐，印巢Ｉ＇．１￣ｄＬ．ｌｆＩＩ胞ｉ－ＩＩ￣Ｉ】 紊乱， 膜增 、＆Ｉｌｌｆ 滋肾育１］ｉｆＪｕｆＩ齐『Ｊ 细胞Ｊ 数较十Ｉ！ 滋肾ｆ『晌儿低刹－１｝ １＿川ｉ（ 、Ｉ ）、 【（（ 、ＩＩ）邴 小 印 病叫 片 爪 略增多，印泡悛细胞 较卡Ｉ！ 组略 多，形态规则，排 １ 齐，Ｉ 川ｉ！ 薄 滋‘ 行ｆ】ｆ７』Ｌ『；’ 寿ｌＪ－ ｉ纠／ｌ（Ｉ、ＬＪ）ｆ１１达 一３５ 儿（Ｋ、Ｉ ） 粒细胞 数较模， 『』ＩＪ 币¨卵池膜细胞）ｘ－￣ｘ卡Ｉｌ Ｊ 『ｌ 薄 Ｉ体 ｝冬１ ｌ、 ２ 沌： ｊ Ｉ １纠ｌ比较，★ ＜０．０５； ｊ模 组比较，▲ ＜ ０．０５ ． ２．４ 滋肾育胎丸对小鼠血清ＩＮｔｆＢ、ＳＣＦ的影响： 表３。 表３滋肾育胎丸对小鼠血清ＩＮｔｔＢ、ＳＣＦ的影响（Ａ：± ） Ｈ－：：‘ｊ审Ｉ ｔ绀比较，★，）＜０．０５； 模 组比较．▲Ｐ＜ ０．０５ ２．５ 各组小鼠卵巢组织形态学的改变： 组（Ａ、Ｂ）卵 巢内存在各级卵泡，颗粒细胞层致密、排列骼齐，膜细胞层 薄， 质细胞致密、排列整齐， ｛膜薄，表面光整。模型组 （Ｃ、Ｉ））小鼠卵巢内囊性扩张的印泡增多，卯泡腔 著扩张， 低Ｊ乏＿Ｊ ｌｉｌ．￣ｌｉｌ（×２０） ｒ低齐ｌｊ ｌ￣，ｌｌ｝ｆ（×４（） 图１ 各组小鼠卵巢组织形态学 浙汀中医杂志２０１７年８月第５２卷第８期 … 。本实验结果 示，肾阳虚型ＰＣＯＳ小鼠血清ＳＣＦ水 平明 低于空白组（Ｐ＜Ｏ．０５），ｍ此，我们推测ＳＣＦ的表 达水平下降可使ＳＣＦ／ｃ—ｋｉｔ信号通路的活性下渊，进而 抑制印泡发育及成熟卵泡的排ｆ 滋肾育胎丸足全同著名中医曼＿ｌ科专家、广州中医药 大学罗元恺教授的经验方，临床上叮用于多囊卵巢综合 征的治疗 滋肾育胎丸ｍ菟丝子、熟地黄、人参、杜仲、首 岛、枸杞子、阿胶、窥角霜、巴戟天、桑寄生、续断、党参、 白术、艾叶、砂ｆ 组成，以温补肾阳为主，佐以益气养血。 方『ｆｌ菟丝子为君药，能补’肾益精同胎；人参、党参、白术 大补元气；鹿角霜补兀－＇２Ｉｔ 日、生精髓；配以巴戟天、卡十仲、续 断、桑奇生益肾 冲；首乌、枸杞子、熟地黄、阿胶填补肝 肾，滋阴养血；艾叶温经散寒，渊经止ｍ；砂ｆ一理气和中。 全方肾、肝、脾同治，能良好地促进印泡发育、诱发排卯。 本实验结果表明滋肾育胎丸高剂璇组小鼠的卵巢组织 形态与空白组基＿水一致，且高剂缱滋肾育胎丸能 著降 低肾阳虚型ＰＣＯＳ，Ｊ、鼠【札清Ｔ、ＬＨ／ＦＳｔｔ、ＩＮＨＢ，升高血清 Ｅ２、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、ＳＣＦ，并能改善其肾阳虚症状，证明滋肾 育胎几对肾阳虚型ＰＣＯＳ有良好的治疗作用。我们猜测 治疗机制可能足通过降低ＩＮｔｔＢ来解除ＩＮＨＢ对ＦＳＨ的 图２各组小鼠卵巢组织形态学 过度抑制，同时增加ＳＣＦ的表达，ｈ调ＳＣＦ／ｃ—ｋｉｔ信号通 路的活性，从而促进卯泡发育及排卯，纠正其内分泌紊 ３讨论 乩状态，最终达到治疗肾阳虚型ＰＣＯＳ的日的 多囊印巢综合征（ＰＣＯＳ）病理环节的根本 于卵泡 ４参考文献 发育异常ｆｌ】排卯障碍一 阳学说 认为，ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值 ［１］李莹，杨晓庆，畅晓葵．抗苗勒管激素干ｕ抑制素Ｂ预测卵 能全面衡醚机体的阴阳偏向。本实验结果 示，模型组 蔡储备功能的临ｊ未研究［Ｊ］．实用妇Ｊ ：科杂志，２０１４，３０（１）： 小鼠卵巢病理切片符合小鼠ＰＣＯ样改变，结合小鼠血清 ２６—２９． 性激素变化、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值改变及肾阳虚症状，说明 ［２］温肖依，谭俊， 琼芳．多囊卵艇综合 患者卯泡发育不 肾阳虚型ＰＣＯＳ小鼠模型建 成功 良 细胞因子 达水平的相关性研究［』］．生殖 ｊ避孕， 现代学者研究 发现．ＩＮＨＢ、ＳＣＦ为卵巢局部冈 ２０１６，３６（１１）：８８２—８８６．９３０． 子，与卵泡的发育及排印有荇密切的关系 ］ＮＩｔＢ是一种 ［３］拿耿，张桔，，ｊ‘两拳，等．地黄丸类办对肾阳虚大敝ＨＰＡ轴 的影响［Ｊ］．中药新约与临床药理，２０１５，２６（３）：３２０—３２＇ｔ． 糖蟹白，有学荇发现 血清ＩＮＨＢ水平在ＰＣＯＳ患者中表 『４］Ｈｅｎｄｒ ｉｘ ＡＯ，ｉｌｕｇｈｅｓ ＣＩ ，Ｓｅ］ｇｒａｄｅ＿Ｊ Ｍｏｄｅｌ ｊ ｎｇ Ｅｎｄｏ— 达升高，推测ＩＮＩｔＢ与ＰＣＯＳ的发病有＿火。Ｈｅｎｄｒｉｘ等研究 ｃｒｉｔｉｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏ ｒ＇ｔｈｅ ｐｊｔｕｉｔｍ、Ｙ—Ｏｖａｒｉａ ｒｌ Ａｘｉ Ｓ：Ａｎｄｒｏ— 发现 ，过 的ＩＮｆｉＢ抑制ｒ垂体ＦＳＨ的合成与分泌，使 ｇｅｎ ｉ ｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈａｏｔ ｉＣ ＤｙＩｍｍｉ ｃｓ［Ｊ］．Ｂｕ１ １ Ｍａｔｈ 卵泡生长受『５ｎ并过早闭锁，彤成多囊卵巢。本实验中， Ｂｉ０ｌ，２０１４，７６：１３６一Ｊ ５６． 模型组小鼠ｍ清ＩＮｔｔＢ水平离于卒白组、ＦＳｔｔ水平低于 ［５］陈婶婷，傅萍，ＪｌｆＩ｛ｉ！，等．多囊卵巢综合 发病机制的影响 守ｎ组，篪蚌均有统计学意义（，）＜０．０５）．与以ｆ 结沦 子研究［Ｊ］．中 优生 遗传杂志，２０１６（１１）：】２２—１２５． 卞Ｒ符。 ［６］李静，崔薇，孙伟，等．电针对多 卵巢综合征大限卜细胞 ＳＣＦ为多肽类物质，是卵巢局部生长【大１子之一 ？有 ｌ太ｌ子及肿瘤坏死【夫ｌ予一ａ表达的涮节［ １］． 旧中医药信息杂 火研究 永 ，较高水平的ＳＣＦ有利于卯细胞的受精和 志，２Ｏ１２（１２）：２６—２８． 优质胚胎的形成ｊＳＣＦ为酪氨酸激酶受体（ｃ—ｋｉｔ）的配 ［７］陶御Ｊｘ【．菟 ｆｊ、 川发微［Ｊ］．浙汀－｛１ｌ隈杂志，２００３，３８ （９）：４４． 体，它与靶细胞ｆ 的ｃ—ｋｉｔ受体结合，激活下游信号通 ［８］下冠民，郝现 ．药物妙用５则［ＩＩ］．浙江中医杂志，２００２， 路，产牛牛物学效应，抑制ＳＣＦ／ｃ—ｋｉ ｔ信号通路会影响 ３７（１Ｏ）：２６． 原始卯泡发育、初级卯泡，卜长及体内成熟印泡的排 收稿日期２０１７－０３—３１
