检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104450936 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.03.25

(21)申请号 201410820825.8(22)申请日 2014.12.25

(71)申请人天津宝瑞生物技术有限公司

地址300457 天津市塘沽区经济技术开发区

洞庭路220号N1402(72)发明人姜坤妤 杜勇 张薇 孙明娣

史斐斐 张文媛 贾后壮 郭江燕郑媛媛(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限

公司 12209

代理人赵瑶瑶(51)Int.Cl.

C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称

检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒(57)摘要

本发明公开了一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，本发明独立设计特异性的引物与TaqMan探针，建立一种荧光PCR检测方法能够同时检测15种临床常见致病真菌，其中包括8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对于侵袭性真菌感染的早期诊断和治疗具有重大意义。 C N 1 0 4 4 5 0 9 3 6 A权利要求书1页 说明书5页

序列表3页 附图3页

CN 104450936 A

权 利 要 求 书

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1.一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物，其特征在于：引物序列如下：引物F1序列：5`-ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3`

引物F2序列：5`-TGACRCTSRRACAGGCATG-3`引物F3序列：5`-TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3`。

2.根据权利要求1所述的检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述常见致病真菌包括8种假丝酵母菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母和热带假丝酵母，4种曲霉菌：黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和烟曲霉，以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。

3.一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR探针，其特征在于：序列如下：荧光探针F1序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3`荧光探针F2序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3`。4.一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物，包括权利要求2所述的探针。

5.根据权利要求4所述的检测常见致病真菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：还包括内参照质控，其引物和特异性检测探针序列如下：

引物N1序列：5`-CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3’引物N2序列：5`-TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3’荧光探针N序列：5’-VIC-CTTGCTTCTTTGCTGACGAG-TAMRA-3’。

6.根据权利要求4所述的检测常见致病真菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述常见致病真菌包括8种假丝酵母菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母和热带假丝酵母，4种曲霉菌：黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和烟曲霉，以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。

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说 明 书

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检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及使用实时荧光定量PCR技术快速鉴定临床样本常见致病真菌的试剂盒及检测方法。

[0001]

背景技术

近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移

植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。深部真菌感染是一种重症感染，死亡率为40-90％，真菌病的发病率近年来呈上升趋势，尤其对重症监护病房和免疫缺陷患者、以及癌症患者，8％的院内感染由真菌引起。[0003] 据统计，近30年深部真菌感染的发病增加了3-5倍，真菌感染已成为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有念珠菌、曲霉菌和隐球菌等。其中念珠菌属感染最多，其次为曲霉菌感染，且侵袭性曲霉菌感染率正逐年升高，病死率较高，而各种抗真菌药物的滥用，更加剧了真菌感染的复发和增加了治疗难度，其感染患者的存活主要依赖于早期诊断和早期治疗。传统的实验室诊断方法耗时太长，耽误时间的同时恐错过最佳治疗时机，同时敏感性较低，因此从技术上解决这一问题颇为重要。[0004] 目前，临床上常用的深部真菌诊断方法有：传统培养法、影像学检查法、血清学检查。以上方法均存在一定的缺陷：传统培养法是诊断真菌感染的最直接方法，准确度高，但其耗时长、易污染、敏感性低的缺点使其不利于临床患者诊断；影像学检查通过高分辨率的机器对患者病灶部位直接进行动态观察，具有重要的提示价值，但此方法不仅特异度低且仅对高危病人具有早期诊断价值；血清学方法具有一定的敏感度和特异性，但诊断的假阳性率较高。

[0005] 目前相对最为先进、也最有发展前景的是分子生物学方法，即PCR，聚合酶链式反应方法。传统的PCR技术虽具有较高的灵敏度，但特异度低，因外源污染等问题容易造成假阳性结果。实时荧光定量PCR技术能够在极短的时间内检测出组织中极微量的真菌DNA，具有较高的灵敏度和特异性。

[0006] 临床常见的侵袭性真菌主要有念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，目前尚未发现使用探针法荧光PCR可以检测不同真菌菌属的报道。

[0002]

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种检测常见致病真菌的荧光

定量PCR引物、探针及试剂盒，本发明独立设计特异性的引物与TaqMan探针，建立一种荧光PCR检测方法能够同时检测15种临床常见致病真菌，其中包括8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对于侵袭性真菌感染的早期诊断和治疗具有重大意义。

[0007]

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说 明 书

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本发明实现目的的技术方案如下：

[0009] 一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物，引物序列如下：[0010] 引物F1序列：5`-ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3`[0011] 引物F2序列：5`-TGACRCTSRRACAGGCATG-3`[0012] 引物F3序列：5`-TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3`。[0013] 而且，所述常见致病真菌包括8种假丝酵母菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母和热带假丝酵母，4种曲霉菌：黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和烟曲霉，以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。[0014] 一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR探针，序列如下：[0015] 荧光探针F1序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3`[0016] 荧光探针F2序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3`。[0017] 一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括上述的引物和探针。

[0018] 而且，还包括内参照质控，其引物和特异性检测探针序列如下：[0019] 引物N1序列：5`-CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3’[0020] 引物N2序列：5`-TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3’[0021] 荧光探针N序列：5’-VIC-CTTGCTTCTTTGCTGACGAG-TAMRA-3’。[0022] 而且，所述常见致病真菌包括8种假丝酵母菌：白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母和热带假丝酵母，4种曲霉菌：黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和烟曲霉，以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。[0023] 本发明取得的优点和有益效果是：[0024] 1、本发明目的在于开发一种快速、灵敏、特异的真菌荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒使用一个PCR反应体系即可检测到15种常见致病真菌(包括白色念珠菌、光滑假丝酵母、*滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉、隐球菌、米根霉和卷枝毛霉)，克服了传统的临床致病真菌检测的缺点和局限性，解决了荧光PCR检测临床样品中真菌感染的难题。[0025] 2、本试剂盒由PCR反应液管、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、阳性对照品管、阴性对照品管、内参照和盒体组成，其中，PCR反应液含有PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、特异性引物和不同荧光标记的探针组成；阴性对照为无核酸酶污染的去离子水；阳性对照为具有目的检测序列的DNA插入到pMD-T载体而构成的重组体，同时，试剂盒使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶和dUTP，有助于避免扩增产物的污染。[0026] 3、本试剂盒同时加入了内参照质控，全程监控核酸提取和荧光PCR检测过程，最大限度的避免了临床检测污染(假阳性)的发生，双通道检测结果准确度更高更可靠。[0027] 4、本试剂盒经实验验证具有较高的灵敏度和特异性，整个检测过程仅需2-3个小时，相比传统检测方法不仅效率大大提高，而且敏感度及特异性都有了极大的改进。附图说明

图1显示荧光定量PCR检测的特异性结果图；

[0029] 图2为特异性实验组内参检测通道检测结果(纵坐标是检测样品的荧光信号值，

[0028]

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说 明 书

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横坐标是循环数)；

[0030] 图3为本试剂盒真菌标准品荧光PCR标准曲线；[0031] 图4为荧光定量PCR检测的灵敏度结果图；[0032] 图5为灵敏度实验组内参检测结果图。

具体实施方式

[0033] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

[0034] 本发明的基本原理是利用靶多核苷酸的特异性引物和靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶(Taq酶)、高质量脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等PCR反应缓冲液中，从而达到快速、实时检测靶多核苷酸的目的。[0035] 本试剂盒由PCR反应液管、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、阳性对照品管、阴性对照品管、内参照和盒体组成。

[0036] PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)0.1mM、特异性引物和不同荧光标记的探针组成，其中引物F1浓度为720nM，引物F2，F3，N1，N2浓度为400nM，荧光探针F1，F2采用FAM标记，浓度为120nM，荧光探针N采用Vic标记，浓度为100nM；阴性对照为无核酸酶污染的去离子水；阳性对照为具有目的检测序列的DNA插入到pMD-T载体而构成的阳性质粒样品；内参照为大肠杆菌菌体冻干粉。[0037] 阳性对照中目的检测序列为：

[0038] CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCA

[0039] 构成本试剂盒的核心即检测常用致病真菌的引物和特异性荧光探针，序列分别如下：

[0040] 引物F1序列：5`-ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3`[0041] 引物F2序列：5`-TGACRCTSRRACAGGCATG-3`[0042] 引物F3序列：5`-TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3`[0043] 荧光探针F1序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3`[0044] 荧光探针F2序列：5`-FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3`[0045] 另外，本试剂盒根据大肠杆菌基因组16S区序列设计内参照质控，其引物和特异性检测探针序列如下：[0046] 引物N1序列：5`-CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3’[0047] 引物N2序列：5`-TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3’[0048] 荧光探针N序列：5’-VIC-CTTGCTTCTTTGCTGACGAG-TAMRA-3’[0049] 本发明所述试剂盒的使用体系为：

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说 明 书

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(2)荧光PCR扩增反应程序如下表所示：[0052] 其中，检测荧光通道为FAM通道；内参照荧光通道为VIC通道；反应体系为25μl。

[0051] [0053]

[0054]

(3)样本提取及检测

[0056] 根据天津宝瑞生物技术有限公司提供的液态样品微量核酸提取试剂盒(P5002)(后面简称为“微量核酸提取试剂盒”)说明书处理及提取样品核酸。[0057] 取上述提取的核酸产物2μl、或2μl阳性对照，加入实时荧光PCR反应管中，按照上面试剂盒使用体系表加入其他成分，反应总体积为25μl。采用ABI7500实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，使用实时数据采集模式。[0058] (4)结果判定

[0059] 真菌(FAM)Ct值>32或者“Undet.”(ABI 7500)者“空白”(LightCycler480)，且内参照(VIC)Ct值<40为阴性；真菌(FAM)Ct值≤30，且有较好的对数增长曲线即为阳性；真菌(FAM)30＜Ct样本＜32为灰度区带，建议重复检验确认。

[0055]

检测结果及附图分析

[0061] 本试剂盒荧光定量PCR检测的特异性

[0062] 图1显示荧光定量PCR检测的特异性结果图(FAM通道)。采用天津宝瑞生物技术有限公司的液态样品微量提取试剂盒提取真菌及临床常见其余致病菌的基因组DNA，随后按照荧光定量PCR反应体系及反应程序进行扩增，检测该试剂盒引物探针的特异性。[0063] 所选用的常见的临床致病菌如下8种：表皮葡萄球菌、粪肠球菌、藤黄微球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、BL21。[0064] 图1中Ct值最小，荧光值最高的曲线为白色念珠菌阳性对照，除了空白对照，其他8中菌的Ct值均大于32，表明本试剂盒的引物和探针具有较高的特异性。

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说 明 书

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图2为特异性实验组内参检测通道检测结果图(VIC通道)。[0066] 由于内参选择的是大肠杆菌基因组内特异性片段，因此该通道结果中大肠杆菌和BL21菌株呈现明显的阳性。

[0067] 由图2可见除空白对照外，各样品检测结果Ct值均小于40，有较好的对数扩增曲线，说明整个核酸提取及PCR扩增、检测过程未引起外源污染，可以确定检测结果中无假阳性结果。

[0068] 本试剂盒荧光定量PCR检测的特异性

[0069] 图4为荧光定量PCR检测的灵敏度结果图。制备各真菌菌悬液，并按照10倍梯度稀释法依次稀释为1×106—1×102CFU/mL菌悬液。采用微量提取试剂盒提取基因组DNA后进行双重荧光定量PCR扩增及检测，结果显示最低可检测出1×103CFU/mL的待测真菌。[0070] 图5为灵敏度实验组内参检测结果图，内参照质控的监测结果显示核酸提取及PCR扩增、检测全过程均未引起外源污染，可以确定该检测不存在假阳性结果，此双通道检测得到的结果更准确，可信度更高。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

图4

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说 明 书 附 图

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图5

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