茚三酮比色法测定聚谷氨酸含量的研究

2，32，3*2，32，3

王进1，，王刚1，，罗丽娟1，，万玉军1，，

2，32，32，3

李南臻1，，庹有朋1，，岳晓敏1，

（1.四川省食品发酵工业研究设计院，成都温江611130；

2.四川省食品防腐保鲜剂微生物发酵技术工程实验室，成都温江611130；

3.四川食品发酵工程技术中心，成都温江611130）

摘要：采用茚三酮比色法对聚谷氨酸含量进行测定。最佳的试验条件为：溶液pH8.0，显色剂用量为1.0mL，

100℃水浴加热20min，冷却10min后在570nm处测定。本方法准确、灵敏、方便、重复性好。关键词：聚谷氨酸；茚三酮；比色法；含量测定中图分类号：TS207.3

TQ922＋.1

文献标识码：A

文章编号：1674-506X（2019）02-0098-0004

ResearchofDeterminationofPolyglutamicAcidbyNinhydrinColorimetry

2，32，3*2，32，32，3

WANGJin1，，WANGGang1，，LUOLi-juan1，，WANYu-jun1，，LINan-zhen1，，

2，32，3

TUOYou-peng1，，YUEXiao-min1，

（1.SichuanFoodFermentationIndustryResearch&DesignInstitute，WenjiangChengdu611130，China；2.SichuanEngineeringLaboratoryofFoodPreservativeAgentbyMicrobialFermentationTechnology，

WenjiangChengdu611130，China；

3.SichuanFoodandFermentationEngineeringTechnologyCenter，WenjiangChengdu611130，China）

Abstract：Thecontentofpolyglutamicacidwasdeterminedbyninhydrincolorimetricmethod.Theoptimum

conditionswereasfollows:thepHvaluewas8.0，andtheninhydrinwasadded1.0mL，heated20minutesinboilwaterandcooled10minutes，finallydeterminedat570nm.Themethodisaccurate，sensitive，convenientandreproducible.

Keywords：polyglutamicacid；ninhydrin；colorimetry；contentdeterminationdoi：10.3969/j.issn.1674-506X.2019.02-020

γ-聚谷氨酸（以下简称γ-PGA），是自然界

中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物［1-2］。γ-PGA具有优良的成膜性、粘结性、极强的吸水性和保水性。医药领域中，γ-PGA可作为释放药物的载体、止血剂、软组织填充剂；在化妆品领域，γ-PGA可用作保湿剂、增白剂并具有持久的抗皱性

收稿日期：2018-12-24

基金项目：微生物发酵制取γ-聚谷氨酸高产菌株选育及发酵条件研究（四川省科技计划项目2018JY0122）作者简介：王进（1965-），男，高级工程师。研究方向：发酵工程。*通讯作者

第55卷（总第210期）王进等：茚三酮比色法测定聚谷氨酸含量的研究

99能［3-4］。γ-PGA还能增强土壤透气性，提高植物根系对氮肥的利用率［5］。干旱缺水是制约我国农业发展及土壤沙漠化的重要原因，γ-PGA可以改善土壤团聚结构与持水能力，有利于沙漠化土壤的改善［6-7］。

本文采用茚三酮比色法对聚谷氨酸含量进行测定，并对相关条件进行探究，以此建立起一种快速、准确测定聚谷氨酸含量的方法。1实验部分1.1试剂和仪器

L-谷氨酸，AR，上海源叶生物科技有限公司；茚三酮，AR，上海澄绍生物科技有限公司；磷酸二氢钾，AR，上海麦克林生化科技有限公司；磷酸氢二钠，AR，山东西亚化学工业有限公司；其它试剂均为分析纯；南京轩凯生物科技有限公司提供聚谷氨酸样品（液体）。

pH计，上海精密科学仪器有限公司；赛多利斯BSA124S电子天平，上海摩速科学器材有限公司；SC-3610离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；SHZ-88A水浴恒温振荡器，苏州培英实验设备有限公司；722N可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。1.2试剂的制备

谷氨酸标准溶液的配制：准确称取干燥谷氨酸0.2000g，定容至100mL，作为母液。准确吸取10mL母液加水定容至100mL即得谷氨酸标准液200µg/mL。

2%茚三酮溶液的配制：将1g茚三酮溶于35mL热水中，加入40mg氯化亚锡，搅拌均匀后置于暗处，隔夜放置，过滤后加水定容至50mL。磷酸盐缓冲溶液：分别配制pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的磷酸盐缓冲溶液。

样品处理：液体样品先经5000r/min离心15min，去除菌体等杂质。取5mL上层清液，加入等量的6mol/L盐酸溶液到比色管中，放入110℃鼓风式干燥箱水解24h。水解后，先用6mol/L的NaOH溶液进行中和反

应，调至pH为7左右，再将其倒入200mL的

容量瓶中做定量稀释即可。1.3实验方法

在25mL的比色管中吸入1mL稀释后的样品，再加入一定量的磷酸缓冲液和茚三酮溶液，补入适量的去离子水，放入水浴摇床中加热。冷却后定容至25mL，在570nm处测定其吸光度。研究不同pH、显色剂用量、加热时间、冷却时间对谷氨酸溶液吸光度的影响。2结果与讨论

2.1反应条件的选择

氨基酸溶液与茚三酮共热，生成氨和还原性茚三酮。氨和还原性茚三酮与另一分子茚三酮反应，生成紫色化合物茚二酮胺。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量［8-9］。

2.1.1溶液pH的影响

在25mL的比色管中加入2.0mL谷氨酸标准液（200µg/mL），管中分别加入1.0mLpH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的磷酸缓冲液和1.0mL茚三酮溶液（20g/L），加去离子水补充容积至6mL，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25mL，倒入比色皿中在分光光度计570nm处测得数值。结果如图1所示：谷氨酸溶液在pH8.0处有最大吸光度。

0.90.8sbA/度0.7光吸0.60.556789pH

图1

pH对谷氨酸溶液吸光度的影响

Fig.1

EffectofpHontheabsorbanceofglutamicacidsolution

1002.1.2

显色剂用量的影响

在25mL的比色管中加入2.0mL谷氨酸标准液（200µg/mL），1mLpH8.0磷酸缓冲液，依次加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL茚三酮溶液（20g/L），然后分别补入2.6、2.4、2.2、2、1.8、1.6mL去离子水，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25mL，倒入比色皿中在分光光度计570nm处测得数值。结果如图2所示：随着显色剂用量增加，吸光度数值随之增大，在1.0mL处接近最大值；进一步增加显色剂用量，吸光度数值无明显变化；故1.0mL为最佳用量。

0.90.8sb0.7A/度0.6光吸0.50.40.30.40.60.81.01.21.4显色剂用量/mL

图2

显色剂用量对谷氨酸溶液吸光度的影响

Fig.2

Effectoftheamountofdeveloperontheabsorbanceofglutamicacidsolution

2.1.3

加热时间的影响

在25mL的比色管中加入2.0mL谷氨酸标准液（200µg/mL），1.0mLpH8.0磷酸缓冲液和1.0mL茚三酮溶液（20g/L），加去离子水补充容积至6mL，放入100℃水浴摇床中分别加热14、16、18、20、22、24min。冷却10min后用去离子水补满25mL，倒入比色皿中在分光光度计570nm处测得数值。结果如图3所示：吸光度数值呈现先增大后降低的趋势，在20min处达到最大值。2.1.4冷却时间的影响

在25mL的比色管中加入2.0mL谷氨酸标准液（200µg/mL），1.0mLpH8.0磷酸缓冲液和1.0mL茚三酮溶液（20g/L），加去离子水补充容积至6mL，放入100℃水浴摇床中加

2019年第2期0.90.8sbA/度0.7光吸0.60.5141618202224加热时间/min

图3

加热时间对谷氨酸溶液吸光度的影响

Fig.3

Effectofheatingtimeontheabsorbanceof

glutamicacidsolution

0.9s0.8bA/度0.7光吸0.60.568101214冷却时间/min

图4

冷却时间对谷氨酸溶液吸光度的影响

Fig.4

Effectofcoolingtimeontheabsorbanceof

glutamicacidsolution

热20min。分别冷却6、8、10、12、14min后用

去离子水补满25mL，倒入比色皿中在分光光度计570nm处测得数值。结果如图4所示：吸光度在冷却10min时达到最大值，随着冷却时间的延长，吸光度无明显变化。2.2标准曲线绘制

取谷氨酸标准液（200µg/mL）0.0、.5、0、1.5、2.0、2.5、3.0mL置于25mL容量瓶，加水补充至容积为4mL，加入茚三酮（20g/L）和pH8.04缓冲液各1mL，放入100℃水浴摇床中加热20min。冷却10min后用去离子水补满25mL，在分光光度计570nm处测得数值。以标准谷氨酸浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。从图5可知，谷氨酸溶液浓度与吸光度呈线性相关，其回归方程为y＝0.0025x－0.184，相关系数R²＝0.9984。

第55卷（总第210期）王进等：茚三酮比色法测定聚谷氨酸含量的研究

1011.41.2y＝0.0025x－0.1833R2＝0.9984s1.0bA/度0.8光0.6吸0.40.200100200300400500600700浓度/μg·mL－1

图5

谷氨酸标准曲线

Fig.5

Glutamicacidstandardcurve

2.3

测定方法的精密度

取1mL稀释后的样品，参照“1.3”显色，进行6次比色测定，结果见表1。该方法测定聚谷氨酸总量的RSD＝0.75%，说明其精密度高，重复性良好。

表1重复性实验结果

Tab.1Resultsofrepetitiveexperiments序号

聚谷氨酸含量0.41910.42120.41830.41340.42250.41762.4

加样回收率试验

取1mL稀释后的样品，测定聚谷氨酸总量作为本底量，以50μg和100μg的谷氨酸纯品作为加标量，进行8次比色测定。由表2可知，平均回收率为96.37%，RSD＝0.86%，表明此法准确度高且重现性好。

2.5比色法与高效液相色谱法结论对比

对不同批次的聚谷氨酸进行比色法测定

表2加样回收率试验Tab.2Samplingrecoverytest

取样量/mL聚谷氨酸加入量测得量回收率平均回RSD1含量10.419/mg0.05/mg0.447/mg/%收率/%/%10.4210.050.44996.4596.4610.41810.4130.050.050.4520.44397.4196.74

10.42210.4170.100.50897.3296.370.86

10.4150.100.4200.100.50196.910.100.4970.50696.5097.88与高效液相色谱测定，并对两种测定结果进

行比较。从图6可知：比色法所得结论与高效液相色谱法结论相吻合，说明比色法准确度高，稳定性好。

比色法测得结果/%

高效液相色谱法测得结果/%

1.81.61.41.20123456图6

比色法与高效液相色谱法结果对比

Fig.6

ComparisonofresultsbetweencolorimetryandHPLC

3

结论

采用茚三酮比色法对聚谷氨酸含量进行测定，最佳的试验条件为：溶液pH8.0，显色剂用量为1.0mL，100℃水浴加热20min，冷却10min后在570nm处测定。本方法准确、灵敏、方便、重复性好，可用于聚谷氨酸含量的测定。参考文献

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