胃癌错配修复基因hMLH1 突变与微卫星DNA 不稳的关系

第23卷第9期第　三　军　医　大　学　学　报Vol.23,No.9

2001年9月ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAESep.2001

论著

胃癌错配修复基因hMLH1突变与微卫星DNA不稳的关系

房殿春,罗元辉,刘为纹　　(第三军医大学附属西南医院全军消化专科中心,重庆400038)

文章编号:1000204(2001)0921012203

　　提　要:目的　探讨胃癌错配修复基因hMLH1突变与微卫星不稳(MSI)的关系。方法　采用PCR为基础的方法检测MSI;采

用二维DNA电泳和DNA测序技术检测hMLH1突变。结果　68例胃癌中检出hMLH1基因突变3例,突变率为4.4%。hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。至少有1个位点发现MSI者17例(25.0%)。将MSI分为高频率MSI(MSI2H,≥2个位点)8例、低频率MSI(MSI2L,仅为1个位点)9例和MSI阴性(MSS)51例3组,4例hMLH1基因突变均发生于MSI2H组,而MSI2L和MSS组未见有突变者。结论　hMLH1基因突变仅是部分MSI发生的原因,MSI的发生可能还涉及到hMLH1以外错配修复基因改变。　　关键词:胃癌;hMLH1突变;二维DNA电泳　　中图法分类号:R342.3;R394;R735.2　　　文献标识码:A

RelationshipbetweenmismatchingrepairgenehMLH1mutationandmicrosatellitein2stability

FANGDian2chun,LUOYuan2hui,LIUWei2wen(DepartmentofGastroenterology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

　　Abstract:Objective　ToevaluatetheroleofhMLH1mutationingastriccarcinogenesisandtocorrelatehMLH1mutationwithmicrosatellitein2stabilityingastriccarcinomas.Methods　hMLH1mutationwasmeasuredbytwo2dimentionalDNAelectrophoresisandDNAsequencing;MSIwasanalyzedbyPCR2basedmethods.Results　Sixty2eightcasesofsporadicgastriccarcinomawerestudiedforhMLH1mutationandMSI.hMLH1mu2taionsweredetectedin3(4.4%)gastriccancer.NoassociationwasobservedbetweenhMLH1mutationandtumorsize,differentiation,histologicaltype,depthofinvasion,metastasisorstages.Byusingfivemicrosatellitemarkers,MSIinatleastonelocuswasdetectedin17of68(25%)ofthetumorsanalyzed.hMLH1mutationswerealldetectedinMSI2H(≥2loci,n=8),butnomutationwasfoundinMSI2Low(onlyonelocus,n=9)orMSS(tumorlackingMSIorstable,n=51).Conclusion　hMLH1mutationisinvolvedincarcinogenesisofsomegastriccancerwithMSI2HinthemajorityMSIcasesingastrictumorsmaybeduetodefectsinothergenesresponsibleforDNAreplicationfidelitythanthehMLH1.　　Keywords:gastriccarcinoma;hMLH1mutation;two2dimentionalDNAelectrophoresis

　　我们过去的研究表明,基因不稳在胃癌的发生中起重要作用。这种基因不稳涉及到两种不同的形式,亦即染色体不稳和微卫星不稳(MSI)[1]。MSI是指由于复制错误引起的简单重复序列的改变,系错配修复(Mismatchingrepairgene,MMR)基因的突变所致。由于MMR基因的突变及功能异常造成DNA频发的复制错误(Replicationerrors,ERE)并不断积累,导致细胞的微卫星DNA序列发生改变。目前已分离和鉴定的MMR基因主要有hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2,他们分别定位于染色体2p21222、3p21、2q31233和7p22。业已证明,MSI阳性胃癌常伴有hMLH1启动子区的低甲基化和hMLH1表达的下调[2],但与hMLH1突变的关系尚缺乏深入的研究。本研究应用二维DNA电泳及DNA测序技术对胃癌错配修复基因hMLH1突变进行检测,并探讨hMLH1突变与MSI的关系。

　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070043);全军“十五”科研基金重

点资助项目(01Z075)

　　作者简介:房殿春(1951-),男,吉林春市人,博士,主任医师,教授,主要

从事胃粘膜病变的分子机制及防治方面的研究,发表论文200余篇。电话:(023)687124

　　收稿日期:2001207230;修回日期:2001208223

1　材料和方法1.1　组织标本

　　68例胃癌及相应正常组织均为我院外科手术切除标本。

标本切除后立即置-80℃冻存备用。每例组织行冰冻切片HE染色,以确定肿瘤细胞的丰度。DNA提取采用蛋白酶K消化,酚/氯仿提取法。68例胃癌中,男45例,女23例,年龄30～76岁,平均56.2岁。所有病人均无肿瘤家族史,亦未接受过放疗和化疗。

1.2　引物

　　参照文献[3]合成长PCR和短PCR引物,序列见表1。

1.3　长PCR扩增

　　应用LAPCR试剂盒(TakaRa,Otsu,Shiga,Japan)进行长PCR扩增。PCR反应体积50μl,包括200～400ng基因组DNA,不同浓度引物(hMLH1基因外显子1～4正义和反义引物各0.16μmol/L,5～10外显子正义和反义引物各0.125μmol/L,11～13外显子正义和反义引物各0.094μmol/L,14～19外显子正义和反义引物各0.125μmol/L)。操作步骤按说明书进行。PCR反应条件94℃热启动2min,加Taq酶,94℃1min,然后98℃

),68℃12min,×15s,69℃1min(每个循环递减0.5℃8个循

环。接着96℃20s,68℃12min,×6个循环。然后96℃20s,68℃12min(每个循环递减15s),×16个循环。最后,72℃反

第9期　　　　　　　　　　房殿春,等.胃癌错配修复基因hMLH1突变与微卫星DNA不稳的关系　　　　　　　　　　　1013应10min。长PCR产物行0.5%琼脂糖凝胶电泳观察。

表1　长PCR和短PCR所用引物

Tab1　PrimerinformationforlongandshortPCRforHMLH1

A.Primerpairsforlong2distancePCRExons124　MLH124FGCG.GCT.AAG.CTA.CAG.CTG.AAG.GAA.GAA.CGT.GAa　MLH124RGGC.GAG.ACA.GGA.TTA.CTC.TGA.GAC.CTA.GGC.CC　Productsize:10.8kbExons5210　MLH5210FGCG.CCC.CTT.GGG.ATT.AGT.ATC.TAT.CTC.TCT.ACT.GG　MLH5210RGCG.CTC.ATC.TCT.TTC.AAA.GAG.GAG.AGC.CTG　Productsize:10.5kbExons11213　MLH11213FCGG.CTT.TTT.CTC.CCC.CTC.CCA.CTA.TCT.AAG.G　MLH11213RGGG.TTA.GTA.AAG.GAA.GAG.GAG.CTT.GCC.C　Productsize:8.7kbExons14219　MLH14219FGGT.GCT.TTG.GTC.AAT.GAA.GTG.GGG.TTG.GTA.G　MLH14219RGCG.CGC.GTA.TGT.TGG.TAC.ACT.TTG.TAT.ATC.ACA.C　Productsize=10.5kbB.PrimerpairsforshortPCR

ExonClampb　ProductsizeTcmPrimersequence15258.13

GCA.CTT.CCG.TTG.AGC.ATC40

CCG.TTA.AGT.CGT.AGC.CCT24018738.14ATA.AAT.TAT.TTT.CTG.TTTCAT.CCT.GCT.ACT.TTG.AGG34023732.22GGA.AAA.TGA.GTA.ACA.TGA2TGT.CAT.CAC.AGG.AGG.ATA4221836.26ACC.CAG.CAG.TGA.GTT.TT40GCC.CAA.AAT.ACA.TTT.CAG017030.19ATA.TTA.ATT.TGT.TAT.ATTCAA.TTT.ACT.CTC.CCA.TGT0

22835.58TTT.CAA.GTA.CTT.CTA.TGAACT.TTG.TAG.ACA.AAT.CTC719430.88GAC.ATC.TAG.TGT.GTG.TTT40CCC.CTT.TTT.TCT.TTT.CAT8521342.21GAC.AAT.AAA.TCC.TTG.TGT50AAG.ATT.TTT.TTA.TAT.AGG94024933.73TTT.GAG.TTT.TGA.GTA.TTTTGG.GTG.TTT.CCT.GTG.AGT105024041.47CAC.CCC.TCA.GGA.CAG.TTTACA.TCT.GTT.CCT.TGT.GAG11.150140.58AGG.TAA.TTG.TTC.TCT.CTTGAA.GTG.AAC.TTC.ATG.CTT11.24022460.81TCC.CAA.GAA.TGT.GGA.TGT2AAA.GGC.CCC.AGA.GAA.GTA12.14018444.53TTT.TTT.TTT.TTT.TAA.TAC.AAAT.CTG.TAC.GAA.CCA.TCT12.2836653.23TGG.AAG.TAG.TGA.TAA.GGT40TGT.ACT.TTT.CCC.AAA.AGG134027249.06ATC.TGC.ACT.TCC.TTT.TCTAAA.ACC.TTG.GCA.GTT.GAG1445238.94TAC.TTA.CCT.GTT.TTT.TGG5GTA.GTA.GCT.CTG.CTT.GTT1017929.97CAG.CTT.TTC.CTT.AAA.GTCCAG.TTG.AAA.TGT.CAG.AAG1626147.56CTT.GCT.CCT.TCA.TGT.TCT.TG40

AGA.AGT.ATA.AGA.ATG.GCT.GTC174019947.01ATT.ATT.TCT.TGT.TCC.CTTAAT.GCT.TAG.TAT.CTG.CCT1845216.67CCT.ATT.TTG.AGG.TAT.TGA.ATGCC.AGT.GTG.CAT.CAC.CA19

282

43.43

TGT.TGG.GAT.GCA.AAC.AGG40ATC.CCA.CAG.TGC.ATA.AATa:Underlinednucleotidesrepresentnucleotidesaddedtomodifymelt2ingtemperaturesoftheprimers;b:GCclampsare:50GCclamp,CGC.CCG.CCG.CCG.CCC.GCC.GCG.CCC.CGC.GCC.CGT.CCC.GCC.GCC.CCC.GCC.CG;45GCclamp,CGC.CCG.CCG.CGC.CCC.CGC.CCC.GTC.CCG.CCG.CCC.CCG.CCC.GGC.CCG;40clamp,CGC.CCGCCG.CGC.CCC.GCG.CCC.GGC.CCG.CCG.CCC.CCG.CCC.G;8clamp,CGT.CCC.GC;5clamp,GCG.CG;2clamp,CG;CTMisgivenin%UF

1.4　多重短PCR扩增

　　取长PCR产物1μl作为模板,进行多重短PCR扩增。分为2个多重PCR组,组Ⅰ包括11对引物,组Ⅱ包括10对引物,每对引物终浓度见表2。PCR反应体积50μl,包括1×PCRbuffer,7mmol/LMgCl2,0.25mmol/LdNTPs,PCR反应条件94℃热启动3min,加TaqDNA多聚酶0.5U。然后94℃1min,52℃45s(每个循环递减1℃),72℃1min,×5个循环。然后94℃1min,48℃45s,72℃1.5min(每个循环增加2s),×15个循环。然后94℃1min,38℃45s,72℃1.5min,×15个循环。最后72℃10min,98℃10min,45℃30min,37℃30min。

表2　多重短PCR分组及引物浓度Tab2　MultiplexgroupsforshortPCR

MultipexgroupⅠ

MultipexgroupⅡ

ExonFinalconcentrationμ(mol/L)

ExonFinalconcentrationμ(mol/L)11.10.37551.5150.521.2512.10.37571.75170.1.62580.375

11.20.5

181.2561.625141.2591.530.62511.25100.625131.625161.012.2

0.325

19

1.75

1.5　二维电泳

　　应用美国CBSScientificCo.研制的DGGE电泳仪(SolanaBeach,CA)进行二维电泳。将PCR产物与上样缓冲液9∶1混合,组Ⅰ取6.5μl,组Ⅱ取8.5μl混合后上样,在0.75mm厚10%聚丙烯酰胺凝胶,于电压140V、温度50℃条件下进行大小(size)分离7.5h。SYBRGreen染色,紫外光下观察分离情况。然后将在120～420bp区的条带呈条形切下,放在预先制备好的1mm厚DGGE胶(含10%～6.5%逆浓度聚丙烯酰胺,25%～70%尿素/甲酰胺)上方,用10%聚丙烯酰胺凝胶封闭后,于电压90～110V,温度56℃条件下电泳16h。凝胶SYBRGreenⅠ和Ⅱ的混合液中染色30min,紫外光下观察并照相。

1.6　DNA测序

　　对发现有异常DNA条带者应用ABI377测序仪(FosterCity,CA)进行DNA测序。

1.7　微卫星不稳(MSI)的检测

　　包括5个微卫星位点:BAT25、BAT26、BAT40、D2S123、和D5S346。检测方法、步骤见文献[1]。与正常组织相比,若肿瘤组织出现泳动的条带即判断为MSI。根据每例肿瘤组织突变型微卫星位点的多少,将其分为高频率MSI(MSI2H,≥2个位点)、低频率MSI(MSI2L,仅为1个位点)和MSI阴性(MSS)3组。

2　结果

2.1　胃癌hMLH1突变率

　　经二维电泳发现异常者均表现为4条DNA带型,见图1。经DNA测序发现68例胃癌中有3例发生hMLH1突变,突变率为4.4%,hMLH1第226密码子CGG变为TGG,导致相应的精氨酸变为色氨酸。hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。

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变者,提示hMLH1突变与部分MSI2H胃癌有关。但多

数MSI2H胃癌并未发现有hMLH1突变,提示多数MSI2H胃癌可能是hMLH1以外的错配修复基因异常,图1　应用二维DNA电泳检测胃癌错配修复基因hMLH1突变

8,13和15外显子见4条带带型

Fig1　DetetionofmismatchingrepairgenehMLH1mutationingastric

cancerbytwo2dimentionalDNAelectrophoresis

Four2bandpatternwasobservedatexon8,13and15

2.2　MSI与hMLH1突变的关系

　　68例胃癌中至少有1个位点检出MSI者17例(25%),其中属MSI2H8例(11.8%)、MSI2L9例(13.2%)和MSS51例(75%)。MSI与hMLH1突变的关系见表3,可见,hMLH1突变均发生于MSI2H组,而MSI2L和MSS组未发现有hMLH1突变者。

表3　MSI与hMLH1突变的关系

Tab3　TherelationshipbetweenMSIandhMLH1mutation

MSIStatusNo.ofcases

hMLH1mutation

MSI2H83MSI2L90MSS

51

0

3　讨论

　　错配修复基因hMLH1是遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)的易感基因,约50%HNPCC家系存在hMLH1的突变[4,5]。已有研究发现,部分家族性胃癌有hMLHl胚系突变[6],但散发性胃癌hMLH1的体细胞突变情况国内外尚缺乏深入研究。本研究采用二维电泳和DNA测序技术检测了68例胃癌组织错配修复基因hMLH1突变,检出突变3例,突变率为4.4%,提示hMLH1突变在散发性胃癌中并非常见。　　我们过去的研究表明,部分胃癌表现MSI。我们首先根据胃癌MSI检出位点的多少,将胃癌分为高频率MSI(MSI2H),低频率MSI(MSI2L)和无MSI(MSS)3

组,结果发现MSI2H胃癌表现为高频率的TGF2βRⅡ、

IGF2ⅡR、BAX、MSH3基因的移码突变和低频率的APC、MCC和DCC的杂合丢失,而MSI2L和MSS胃癌却表现为相反的结果。但MSI与hMLH1突变的关系尚缺乏深入的研究。本研究发现,3例hMLH1突变均发生于MSI2H胃癌,而MSI2L胃癌未发现有hMLH1突

或hMLH1基因的其它失活方式所致。业已发现,在晚期MSI2H胃癌常伴有hMLH1启动子区的高甲基化和hMLH1表达的下调[6]。因此进一步研究MSI2H胃癌hMLH1启动子区的甲基化状态、hMLH1的表达和其他错配修复基因改变,对揭示MSI2H胃癌的发生机制可能有重要意义。

　　hMLH1基因较大,含有19个外显子,以往检测hMLH1基因突变多采用SSCP方法、梯度变性胶电泳和DNA测序等技术,但这些技术需时长,工作量大,花费亦大,不适合大规模的突变分析[3]。二维凝胶电泳是近年建立的新的基因突变分析方法[8,9]。本方法包括2步PCR扩增和2步电泳分离。即先行包括4对引物的长PCR扩增hMLH1基因的19个外显子的全长序列,再以长PCR产物为模板,进行2套多重短PCR扩增,然后先在非变性丙烯酰胺凝胶进行扩增片段大小分离,再在梯度变性胶上进行第2次分离。本研究采用二维电泳方法检测了hMLH1基因19个外显子突变,结果表明该法操作简便,无需复杂设备,所需的检测样品少,准确性和可重复性好,能在同1张电泳胶上同时观察hMLH1基因19个外显子突变,因此可降低工作量,并降低花费,不但可以用于科学研究,而且可以用于临床标本的检测。参考文献:

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(编辑　谢义霞)