pcr扩增的原理和步骤

pcr扩增的原理和步骤

聚合酶链反应( CR)是分子生物学中的一种科学技术，将一段DNA的一个或几个拷贝跨越几个数量级，产生数千到数百万个特定DNA序列的拷贝。 目前，PCR是一种常见的、经常不可缺少的技术，用于医学和生物研究实验室的各种应用。PCR技术涉及三个主要步骤：变性、退火和扩展。PCR技术有助于对越来越多的疾病进行调查和诊断。 定性PCR不仅可以检测人类基因，还可以检测细菌和病毒的基因。PCR也被用于法医实验室，并且特别有用，因为只需要少量的原始DNA。PCR可以识别与癌症发展有关的基因。分子克隆得益于PCR作为一种技术的出现。

基本概念

PCR基本原理简单。顾名思义，它是一个链式反应：一个DNA分子被用来产生两个拷贝，然后是四个，然后是八个等等。这种连续的加倍是由特定的蛋白质完成的，称为聚合酶，这种酶能够将单个DNA构建块串在一起形成长分子链。 要完成他们的工作聚合酶需要提供DNA构建块，即由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)组成的核苷酸。他们还需要一个小的DNA片段，称为引物，他们将构建块以及一个较长的DNA分子连接起来，作为构建新链的模板。 如果提供这三种成分，酶将构建模板的精确副本。 PCR是一种用于获取任何特定核酸链的许多拷贝的方法。这是一种选择性地扩增DNA特定片段的手段。该片段可能代表DNA大而复杂的混合物的一小部分。人类基因的特定外显子。 它可以被认为是分子复印机。PCR可以在~2小时内扩增出可用数量的DNA（通过凝胶电泳可见）。模板DNA不需要高度纯化一个煮沸的细菌菌落。可用限制性内切酶对PC R产物进行酶切，测序或克隆。PCR可以扩增单个DNA分子，例如，从一个精子 聚合酶链反应依赖于DNA复制酶在高温下保持稳定的能力。PCR已经改变了几乎所有需要操纵DNA片段的研究都可能由于其简单和有用而进行的方式。在Mullis的原始PCR过程中，该酶

被用于体外。将双链DNA加热至96°C，分离成两条单链DNA。然而，在这个温度下，大肠杆菌DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热阶段后，酶必须补充新的新鲜酶。 穆利斯最初的PCR过程非常低效，因为它需要大量的时间、大量的DNA聚合酶，以及整个PCR过程中的持续关注。

PCR技术的步骤

有三个主要步骤：变性、退火和扩展。在第一步中，DNA在高温下（从90~97摄氏度）被变性。 在第二步中，引物退火到DNA模板链上，以进行主要扩展。在步骤三中，延伸发生在退火引物的末端，以创建DNA的互补拷贝链。这有效地使DNA数量加倍，通过PCR周期的第三步。为了用PCR扩增DNA片段，样品首先加热，使DNA变性，或分离成两片单链DNA。接下来，一种名为“Taq聚合酶”的酶合成了两条新的DNA链，使用原始链作为模板。这一过程导致原始DNA的复制，每个新分子都含有一条旧的和一条新的DNA链。然后这些链中的每一个都可以用来创建两个新的副本，以此类推。退火相发生在较低的温度，50-60°C。这使得引物能够杂交到它们各自的互补模板链，这是法医化学非常有用的工具。然后，新形成的DNA链的引物连接到模板，然后用于创建相同的副本，从原来的模板链所需的。Taq聚合酶在退火引物的末端添加可用核苷酸。引物的延伸由Taq聚合酶发生在大约72°C下2-5分钟。 DNA聚合酶I不能被用来拉长引物，因为它在PCR所需的高温下是不稳定的。 PCR周期和过程的优点是与其他技术相比非常快，每个周期将所需DNA链的拷贝数加倍。 经过25-30个周期，无论谁在DNA样本上进行PCR过程，都会有大量原始DNA样本的副本进行实验。假设每一步的最大时间，30个周期只需6小时就能完成。

随着变性、退火和聚合酶延伸的过程继续进行，引物在新合成的链中反复与原始DNA模板和互补位点结合，并被扩展以产生新的DNA拷贝。最终结果是DNA片段总数的指数

增加，其中包括PCR引物之间的序列，这些序列最终以理论丰度为2n表示，其中n是循环数。

由于引入了一种耐热DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶一次，在PCR反应开始时。从生长在110多°C间歇泉中的Thermus水生植物(Taq)中分离出DNA聚合酶活性的热稳定性，对聚合酶链反应的产率、特异性、自动化和效用有很大的贡献。Taq酶能够承受重复加热到94°C，因此每次混合物冷却以允许寡核苷酸引物结合催化剂的延伸已经存在。最后一个周期后，样品通常在72°C下孵育5分钟，以填充新合成的PCR产物的突出端。为了确保成功，应注意制备反应混合物和设置循环条件。将周期数增加到35~以上几乎没有积极的作用，因为当试剂耗尽时，平台发生积累。扩增的特异性取决于引物在多大程度上能够识别和结合预期的目标DNA序列以外的序列。

方法

在分子生物学中，实时聚合酶链反应，又称定量实时聚合酶链反应，是一种基于PCR的实验室技术，用于扩增和同时定量靶向DNA分子。传统上，PCR是在一个管中进行的，当反应完成时，通过凝胶电泳分析和可视化反应的产物(扩增的DNA片段)。然而，实时PCR允许分析产品，而反应实际上正在进行中。这是通过使用各种荧光染料来实现的，这些染料与放大的产物反应，并且可以用仪器测量。这也有利于DNA的定量。定量PCR(Q-PCR)，如这一技术已知，用于测量PCR产物的数量(通常在实时PCR过程中)。 定量测定DNA、cDNA或RNA的起始量是首选方法。因此，PCR通常用于确定样本中是否存在DNA序列以及样本中其拷贝数。实时PCR的另一个优点是检测速度快，因为在DNA扩增反应后不需要进行电泳或其他程序。数字PCR概念是由Sykes等人于1992年构思的。它是对传统聚合酶链式反应方法的改进，可用于直接定量和克隆扩增核酸，包括DNA、cDNA或RNA。dPCR和传统PCR的关键区别在于核酸量的测定方法，前者比PCR更精

确。PCR每单个样品进行一次反应。在样品中，dPCR也进行单个反应，但样品被分离成大量的分区，反应是在每个分区中单独进行的。 这种分离可以更可靠地收集和敏感地测量核酸的数量。反向PCR是聚合酶链反应的一种变体，它只用一个已知序列来扩增DNA。传统PCR的一个限制是，它需要与靶DNA的两个末端互补的引物，但这种方法允许进行PCR，即使只有一个序列可供设计引物。嵌套聚合酶链反应是对聚合酶链反应的一种修饰，目的是减少由于扩增意外引物结合位点而导致的产物中的污染。触地聚合酶链反应是一种聚合酶链反应方法，引物将避免扩增非特异性序列。触地聚合酶链反应循环的最早步骤具有较高的退火温度。 退火温度在随后的每一组循环中以递增的方式降低。