细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡的研究进展

姓名：郝先行

学号：10000821

学院：通达学院

摘要：细胞凋亡(apoptosis)是机体正常细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程,是一个主动、高度有序、基因控制及一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生物健康生存过程中扮演着关键角色,对个体的正常发育具有重要作用。机体在产生新生细胞的同时,衰老和突变的细胞通过凋亡机制而被清除,使器官和组织得以正常地发育和代谢。细胞凋亡发生异常会导致疾病的发生,如肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等。本文概述了细胞凋亡的特征、分子机理、2条主要信号途径、检测方法、生物学意义及与疾病的关系。

关键词：细胞凋亡；分子机理；信号通路；检测方法；疾病

参考文献：

1.潘耀谦 高丰.细胞凋亡与细胞坏死比较的研究进展[J].动物医学进展，2000，21(4)：5-8.

2.唐兆新 高洪.细胞凋亡的生化特征和生物学意义[J].动物医学进展，1998，19(4)：

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3.高利波 高洪.细胞凋亡与疾病防治[J].动物医学进展，2001，22(2)：37-38.

4.宋建领 王金萍 等.细胞凋亡的研究近况[J].云南畜牧兽医，2003(1)：5-7.

5.Kerr J FR., Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis Its significance in cancer and cancer therapy[J]. Cancer ,1994 ,73 :2013～2026.

6.Vaux DL. . Apoptosis timeline[J]. Cell Death Differ ,2002 ,9 :349～354.

7.杨宇泽 师如意 谷传慧.细胞凋亡的特征、检测方法及生物学意义[J].上海畜牧兽医通讯，2008(5)：67-67.

动物体内的任何细胞或迟或早总会死亡的，但死亡的形式不同，有的是生理死亡，我们称之为凋亡，有的则为病理性死亡，被叫做坏死。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及其复杂的分子生物学机制。细胞凋亡在生理条件下作为机体细胞群生长消亡平衡的重要方式，与细胞增殖一起共同维持细胞群的自身稳定，对生物体内环境的稳定起着重要的作用[1-3]。近几年，由于各种生化及生物学技术应用到这一研究领域，揭示了细胞凋亡不仅是一种重要的生物学现象，而且对于疾病发生的机制及新的治疗研究都有重要意义，因而成为生物学和医学研究中的一个热门话题。细胞凋亡（apoptosis）是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏过程，自动结束其生命。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，又称为细胞编程性死亡（programmed cell death,PCD）。现已发现许多与细胞凋亡相关的调控基因，决定着细胞生死命运[4]。

1. 细胞凋亡的特征

细胞凋亡的发生过程,在形态学上有如下现象:

凋亡细胞在电镜下表现为:细胞核缩小,电子密度增高,核膜皱缩,染色体密集于核膜下,分布不均匀,后来,核被分解成碎片,核碎片在胞质中与细胞器等成分一起被细胞膜包裹,从外观上看,细胞表面产生了许多泡状或芽泡状突起。以后,逐渐分隔,形成单个的凋亡小体[5]。此后,细胞质密度增高,细胞骨架可被破坏,但细胞器的结构可以保持到细胞凋亡后期。内质网在细胞凋亡后期扩张成泡状,与细胞膜融合成胞质气泡。这时,凋亡小体逐渐脱离细胞体,进入间质。于是凋亡细胞被逐步解体。从细胞凋亡开始,到凋亡小体的出现才数分钟,而整个细胞凋亡过程可能延续数小时[6，7]。

2. 细胞凋亡的分子机理

基因是生物体活动的总指挥，调控细胞的生长与凋亡。细胞凋亡的主动性和程序性以及细胞凋亡时的形态学和生化变化也是一系列基因的激活、表达、调控的结果。细胞凋亡的相关调控基因相互牵制，相互影响，共同影响细胞凋亡[8]。其途径主要有两条,一条是通过细胞膜上的死亡受体激活半胱氨酸蛋白酶Caspase,另一条是通过胞质内的线粒体途径释放细胞凋亡因子激活半胱氨酸蛋白酶Caspase。这些活化的Caspase可将细胞内的重要蛋白降解,引起细胞凋亡。其中研究较多的有ICE、Apaf -1、Bcl-2、Fas/APO-1、C- myc、p53、ATM等。本文主要探讨了Bc-2、C-myc、p53、Caspase、Fas/APO-1等的功能。

2.1 Bcl-2基因家族

在细胞凋亡过程中, Bcl-2蛋白家族成员起着至关重要的作用。它们具有较高的同源性,

而且还有BH1 (Bcl-2 homology domain 1)、BH2、BH3、BH4等保守结构域。Bcl-2家族可以分为两大类:一是抗凋亡的,主要有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等;二是促细胞死亡的,主要包括Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等。Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等是细胞死亡的负调因子,在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡[9]。

线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能来抑制凋亡: ①Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位从而调控细胞凋亡。在细胞凋亡中,线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器,Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄,降低胞内的氧化还原电位,来抑制细胞凋亡的。②Bcl-2能调节粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成份,它在较高pH的条件下能形成离子通道,而Bax则能在较为广泛的pH范围内形成孔道。Bax能允许一些离子和小分子如细胞色素C(cytochrome C)等穿过线粒体膜,进入细胞质,从而引起细胞凋亡;而Bcl-2的作用正好相反,它能封闭Bax形成孔道的活性,使一些小分子不能自由通透,从而保护细胞免于凋亡。③Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上, 使其不能发挥凋亡作用。

2.2 C-myc与细胞凋亡

C-myc属于原癌基因,对细胞具有两方面的作用,既可参与细胞的增生转化,又可诱导或促进细胞凋亡的发生,是一种早期快反应基因。它的表达可以使细胞从G0期过渡到G1期,细胞周期变短,分裂加速。而在细胞分化时, C-myc表达降低,细胞生长受到抑制。C-myc可以诱导成纤维细胞、杂交瘤T细胞、白血病细胞等发生凋亡,且这种作用可因Bcl-2或突变型p53的表达而被抑制[10]。

2.3 抑癌基因p53

抑癌基因p53编码产物与肿瘤的发生、发展相关,为肿瘤抑制基因。p53可分为两种类型,一种是可诱导细胞发生凋亡的野生型,另一种是具有抑制凋亡能力的突变型。野生型p53是作为细胞周期G1的控制蛋白而发挥作用的,当DNA损伤时,p53编码的转录活化蛋白聚集在DNA损伤部位,使DNA受损细胞停止在G1期,阻止DNA复制,从而使DNA得到修复,若DNA受损细胞修复失败,则p53介导细胞凋亡。如果DNA受损细胞逃脱了p53的监控,细胞就在遗传物质变异的基础上不断增殖而癌变[11]。

2.4 Caspase蛋白酶家族

Caspase蛋白酶参与Fas诱导的细胞凋亡,与线虫细胞凋亡基因Ced-3同源,能选择性降解蛋白质。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶,这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶,一旦被信号途径激活,能将细胞内的蛋白质降解,使细胞不可逆地走向死亡。它们均有以下特点: ①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性; ②总是在天冬氨酸之后切断底物,所以命名为Caspase (cysteine aspartate-specific protease); ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体,大、小亚基由同一基因编码,前体被切割后产生两个活性亚基[11]。

2.5 Fas与细胞凋亡

Fas(又称APO-1或CD95) ,与Bcl-2基因是凋亡相关基因中作用相反的两个典型代表。其为TNFR家族成员,基因产物为一跨膜糖蛋白。与其配体FasL或Fas抗体结合后,经特殊胞内蛋白介导,直接激活凋亡基因产物,诱导Fas蛋白所在的细胞凋亡[11]。

2.6 抑制分子

迄今为止, 已发现多种凋亡抑制分子, 包括p35、CrmA、IAPs、FLIPs、Bcl-2家族。

p35和CrmA是广谱凋亡抑制剂,是由病毒基因所编码的蛋白质。p35来自于杆状病毒, CrmA来自牛痘病毒。体外研究结果表明p35以竞争性结合方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制Caspase活性。同时被靶Caspase特异切割后的p35与Caspase的结合更强, CrmA (Cytokine response modfer A)是血清蛋白酶抑制剂,能够直接抑制多种蛋白酶的活性,但目前还未发现在哺乳动物中发现p35和CrmA的同源分子[11]。

3. 细胞凋亡的2条主要信号通路

3.1 受体依赖的细胞凋亡的信号传导通路(外部途径)

半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶,这个家族的蛋白酶具有特异性地在特定的氨基酸序列中将肽链从天门冬氨酸(Asp)之后切断的活性[12]。Caspase在细胞内是以无活性的酶原形式存在的,凋亡启动后它们是怎么被激活的呢? 首先,死亡受体被触发. 死亡受体被激活后,并不能把凋亡信号直接传递给Caspase,其胞浆区还要与一些信号转导蛋白结合,其中重要的是含有死亡结构域的胞浆蛋白(adaptor)。这种胞浆蛋白的共同特点是分子的C2末端含有死亡结构域,与相关受体胞质内的死亡结构域相互作用,其N2末端含有死亡效应子结构域。同种结构域间有相互结合的倾向(趋向性),这样死亡配基与其配体结合后导致死亡受体的死亡结构域相互聚集并与adaptor的死亡结构域相互结合。死亡受体与adaptor结合后导致细胞内procaspase-8 ,-10 ,或-2在局部的募集,因procaspase分子中含有与adaptor分子相似的死亡效应子结构域,可以相互串联结合,这样就由“死亡配基-死亡受体-adaptor-procaspase”以串联方式组合而成了一个大分子复合物. 复合物形成后, 其内部的procaspase分子其周围募集的其他procaspase相互靠近而进行自身催化水解,成为具有水解活性的蛋白酶(接近诱导)。Caspase蛋白酶家族作为细胞凋亡的执行者,它们活化后进一步剪切底物,如多聚(ADP2核糖)聚合酶(PARP),该酶与DNA修复及基因完整性监护有关, PARP被剪切后,失去正常的功

能,使受其抑制的核酸内切酶活性增高,裂解核小体间的DNA ,最终引起细胞凋亡。这个过程可概括为:死亡受体——含有死亡结构域的胞浆蛋白——Caspase蛋白酶家族——底物PARP——染色体断裂——细胞凋亡[14,15]。

3.2 Caspase活化的内部途径(也称线粒体途径)

这条途径是通过死亡信号诱导线粒体释放细胞色素C(Cyt2c)实现的。Cyt2c位于线粒体内膜与外膜之间的膜间隙内,是呼吸链中电子传递必需的一类色素蛋白。Cyt2c由核基因编码,在胞浆核糖体中释放生成Cyt2c前体,并转移入线粒体内与亚铁血红素基团共价结合形成完整结合状态的Cyt2c。Cyt2c自线粒体释放入胞浆是诱导细胞凋亡的关键环节。Cyt2c是如何释放入胞浆的呢? 目前发现有两种有争议的机制: 1)在多种刺激因素下(如氧化剂、Ca2+超负荷等) ,线粒体内膜蛋白和外膜蛋白相互作用而形成一种大的“渗透性转移孔道”,允许水、盐等相对分子量小于15kD的分子进入线粒体,使其肿胀,外膜破裂,Cyt2c和其他一些蛋白释放；2)允许Cyt2c通过的电压依赖性阴离子通道(VDAC)的形成。在线粒体外膜上可能形成一个大的VDAC使Cyt2c得以释放入胞浆中,由于Cyt2c与血红素基团结合后的不可扭曲性,该通道孔径至少应大于Cyt2c。VDAC通道形成的假说在一定程度上解释了大多数不伴随线粒体肿胀、破裂的细胞凋机制[13]。

Cyt2c释放入胞液后与凋亡蛋白酶激活因子21(Apaf21)结合,Apaf21由三个结构域组成,其N2末端含有一个Caspase募集结构域(CARD)。Apaf21与Cyt2c结合后在dATP存在的条件下发生构象改变,继而寡聚化。然后Apaf21的CARD区与procaspase29的N2末的CARD区结合, 形成“Cyt2c—Apaf21—Procaspase29”复合体。同样,复合体上的procaspase29与其周围募集的其他procaspase29相互靠近,发生自水解而活化,活化的Caspase29再激活下游的Caspase效应分子,通过降解PARP和核纤层蛋白等引起染色体断裂,导致细胞凋亡[14]。

4. 细胞凋亡检测方法

4.1 细胞形态学观察法

凋亡小体的形成是细胞凋亡的主要形态学特征,过去人们常用光学显微镜和透射电子显微镜来进行观察。利用光学显微镜可以观察到核固缩、质浓缩和凋亡小体;通过透射电子显微镜还能够清晰的观察到细胞微绒毛的消失、内质网、高尔基复合体及核被膜的膨大,染色体的边集化及凋亡小体。对凋亡形态学的观察还可利用相差显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,相差显微镜可以观察到细胞膜的出芽和凋亡小体的形成,适用于研究细胞凋亡的动态变化过程;共聚焦激光扫描显微镜除了用于形态学的观察以外,还能做大分子的定位。形态学检测方法最大的局限性是只能定性,不能有效定量,而且判定时难免存在主观性,故常作为其他检测方法的基础[16]。

4.2 免疫学和分子生物学方法

4.2.1 DNA凝胶电泳 正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带：凋亡细胞由于DNA被裂解成单个核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的“阶梯状”条带，坏死细胞的DNA是被随即破坏的，电泳时出现类似血涂片的连续性改变。这是判断细胞有无发生凋亡的一种简便方法。但该法敏感性较差，检测敏感度为106个细胞/ml以上，只适用于含有单一细胞成分标本的测定，对组织细胞组成复杂者，不能确定凋亡发生于哪类细胞[8]。

4.2.2 酶学检测 主要检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases23)、蛋白酶PARP、端粒酶等的活性。常采用荧光分光光度计检测Caspases23的活性。因活化的Caspase23能够特异切割DIE2V3D42X底物,水解D42X肽键,故设计出荧光物质偶联的短肽Ac2DEVD2AMC。在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的

AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度大小,可测定Caspase23活性,从而反映Caspase23的活化度,以判断细胞凋亡程度。PARP (聚多聚酶)可特异性地识别DNA断裂末端并结合,是一种重要的DNA修复酶。在凋亡早期,Caspases作用于PARP,使其裂解为89、24ku的2个片段,修复作用丧失。以抗PARP抗体用蛋白印迹法检测PARP的89ku片段,可作为凋亡早期的标志物。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核蛋白,正常的体细胞是没有端粒酶活性的,随着细胞分裂,染色体的端粒会缩短。如果待测样品中有该酶的活性,可以在底物上连接上不同个数的6碱基(GGTTAG)端粒重复序列,通过PCR 反应产物经电泳检测可以观察到相差6个碱基。酶学检测简单、快速、方便,适合大量培养细胞的凋亡检测,但不能定量和定位[16]。

4.2.3 原位杂交或免疫组织化学方法 利用原位杂交、免疫组织化学等实验，检测Bax、Bcl-2、c-myc、Fas/fasL等凋亡相关调控基因的表达水平。此方法适用于冰冻或石蜡包埋的标本，方法相对简便易行，可原位观察目的基因在哪些种类细胞表达及具体分布[8]。

4.2.4 免疫印迹技术 通过电泳分离细胞核基因组DNA或目的蛋白质，然后电印迹转移到硝酸纤维素膜上，用带有放射性标记的DNA探针与之杂交或蛋白质特异性抗体共同孵育，利用放射自显影技术或光化学底物进行显色进行观察[8]。

4.2.5 TUNEL测定法 TUNEL测定法又称DNA断裂原位末端标记法。由于凋亡细胞DNA为核酸酶所降解产生3’-OH的缺口和末端,故可用原位缺口平移法或原位末端标记法显示凋亡细胞。根据需要可采用生物素、地高辛、荧光素和同位素等进行标记。比如,标记的荧光素可在荧光显微镜下观察或在流式细胞仪上进行定量分析凋亡与非凋亡细胞。原位标记法的最大优点是能在组织切片上识别难于辨别的凋亡细胞,不足之处为缺乏专一性,但可结合形态学予以正确判断[11]。

4.2.6 彗星电泳法 彗星电泳法(comet assay) ,原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中,经裂解处理后,在电场中进行短时间的电泳,并用荧光染料染色。凋亡细胞中形成的DNA降解片断,在电场中泳动速度较快,使细胞核呈现出一种彗星式的图案; 而正常细胞的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形,这是一种快速简便的检测凋亡细胞的方法[11]。

4.2.7 流式细胞分析 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器,它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体,是一种非常先进的检测仪器,被誉为试验室的“CT”。流式细胞术( Flow CytoMeter, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术[11]。

5. 细胞凋亡的生物学意义

细胞凋亡在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色,它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要的意义。

5.1 有利于清除有害细胞

在研究自身免疫性疾病、病毒感染和肿瘤的机制中发现自身反应性T、B淋巴细胞、某些病毒感染细胞和一些肿瘤细胞可以通过细胞凋亡方式被清除,推测机体可能利用细胞凋亡作为自身的一种保护机制。一般认为恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长,过度增殖,而从细胞凋亡的角度看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制,不能正常进行细胞死亡清除的结果

[7]。

5.2 有利于清除完成正常使命的衰老细胞

人红细胞分化成熟后是无核有功能细胞,可存活120d ,然后自然死亡。动物表皮不断角化脱落,是细胞从有生命向无生命转化过程。胃肠道上皮一边脱落死亡,一边再生补充,相互交替。这些有序的细胞编程性死亡现象是维持个体正常生理活动及功能表达所必需的[7]。

5.3 维持器官、组织、细胞数目相对平衡

细胞凋亡是同细胞增殖相反的过程,两者既对立又统一,相互协调,有条不紊。细胞增生低下和凋亡过盛,引起器官萎缩。肿瘤发生既与细胞增殖过度有关,又与细胞凋亡不足有关。总之,认识细胞凋亡是认识正常生命规律的重要基础,也对认识异常死亡的疾病十分重要[7]。

6. 细胞凋亡与疾病

近几年研究表明，多种疾病的病理发生与生理性细胞死亡失常有关。细胞凋亡除受内源性凋亡原控制外，还受外源性凋亡原包括生物性、物理性、化学性因素的调控。内源性调节蛋白和激素如转化生长因子β1、肿瘤坏死因子家族、糖皮质激素等均可诱导凋亡。生物因素有病毒、细菌及其毒性产物，物理因素射线、高温和缺氧，化学因素包括半乳糖胺、酒精、一氧化氮、亚砷酸钠、铅以及抗癌剂秋水仙碱、放线菌素D、放线菌酮、阿霉素等。以上诸多凋亡原对不同的细胞产生细胞凋亡抑制或增强引起不同的生理性或病理性反应

[2,17]。

6.1 细胞凋亡与病毒感染

近年来发现某些病毒可通过诱导细胞凋亡的途径来杀死细胞，并发现一些与这一过程

相关的病毒基因，包括诱导细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。病毒感染细胞后通过自身基因的表达或激活宿主细胞凋亡相关基因，启动或抑制细胞凋亡的调控是受感染细胞命运的关键因素。众多研究表明，IBDV可诱导CEF细胞、PBL细胞、法氏囊淋巴细胞、Vero细胞、鸡胸腺细胞发生细胞凋亡，并观察到细胞凋亡的典型形态和生化变化。小鸡感染IBDV之后，IBDV诱发了B淋巴细胞的凋亡，造成B淋巴细胞减少，导致免疫抑制[18]。随着病毒感染细胞、调控宿主细胞凋亡的研究不断深入，将为病毒性疾病的致病机理、预防、治疗、诊断的研究提供新的理论依据及相应对策。

6.2 细胞凋亡与化学因素

一氧化氮(NO)是一种自由基性质的气体，为污染空气的常见有毒成分之一。最近发现NO与细胞凋亡关系密切，可诱发多种细胞发生凋亡，并与其他活性氧自由基的凋亡传导途径存在对话效应，NO诱导凋亡促进P53基因表达，其分子作用机理正是目前的研究重点[17]。内皮细胞由于其分布特殊，在结构和功能上均很重要，内皮细胞的凋亡可导致血管内皮屏障功能的丧失，使血管易于渗漏及组织器官水肿，研究表明血管内皮细胞凋亡与细胞内氧化应激有关，还原型谷胱甘肽对亚砷酸钠诱导的培养内皮细胞凋亡有明显的保护作用。铅引起细胞死亡可通过两种不同的途径：一个途径为一定剂量的铅通过启动细胞内的凋亡程序，促使细胞凋亡，另一个途径为在铅质量浓度过大时，直接引起细胞发生坏死[4]。

6.3 细胞凋亡与自身免疫疾病

细胞凋亡是正常T细胞和B细胞分化和稳定的重要机制，近年来，越来越多的研究表明细胞凋亡在自身免疫疾病的发病机制中起到的重要作用。Fas/FasL途径介导的细胞凋亡的抑制是产生自身反应性T细胞和自身抗体的主要原因。细胞凋亡的抑制能引起细胞因子的异常分泌，异常的细胞因子谱反过来抑制细胞凋亡，使得T细胞和B细胞等免疫细胞自我耐受

发生破坏和自身抗体大量产生，对机体形成损伤。近几年来，对于自身反应性淋巴细胞的凋亡分子机制的知识积累很快，相信随着对细胞凋亡研究的进一步深入，将会更全面地了解自身免疫疾病的发病机理，对预防和治疗自身免疫疾病有重要意义[19]。

5.4 细胞凋亡与肿瘤疾病

细胞凋亡受抑制，细胞存活期延长，死亡率下降，细胞数量增加，使得这些细胞表现出明显的生长优势，DNA受损的细胞得以持续生存，突变物积聚，从而促进肿瘤的发生发展[2]。肿瘤细胞常呈凋亡不足，放疗、化疗、凋亡素和单抗协同或共刺激等均可诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明Fas表达于多种肿瘤细胞，并可介导肿瘤细胞凋亡，因此进一步研究肿瘤细胞中Fas介导凋亡敏感性的机制，逆转某些肿瘤细胞Fas凋亡抗性，将为肿瘤治疗提供新的前景4]。