嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105368746 A (43)申请公布日 2016.03.02

(21)申请号 201510867449.2(22)申请日 2015.12.01

(71)申请人山东新华医疗器械股份有限公司

地址255086 山东省淄博市高新区泰美路7

号新华医疗科技园(72)发明人赵健存 韩宝福 屈道银(74)专利代理机构青岛发思特专利商标代理有

限公司 37212

代理人马俊荣(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12N 3/00(2006.01)C12R 1/07(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页

()发明名称

嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法(57)摘要

本发明属于微生物芽孢发酵技术领域，具体涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法。制备方法是菌种热激，菌种活化，菌种冷刺激，一级培养，二级培养，即得。本发明根据嗜热脂肪芽孢杆菌的特点，采用热激、活化、冷刺激和逐级培养的手段，使该芽孢杆菌能够在发酵的过程中快速形成芽孢，缩短发酵时间，降低生产成本，提高使用效果；而且工艺简单、成本低廉，具有可操作性强的优点。

C N 1 0 5 3 6 8 7 4 6 A CN 105368746 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)菌种热激：菌种在水浴中加热；(2)菌种活化：在菌种活化培养基上进行菌种培养；(3)菌种冷刺激：将活化好的菌种在-10－-20℃放置1-2h；(4)一级培养：在芽孢生长培养基上倒置培养；(5)二级培养：在芽孢生长培养基上倒置培养，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。2.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的水浴温度为50-60℃。

3.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的加热时间为4-6h。

4.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的菌种用无菌水稀释到浓度为1×106-3×106cfu/ml。

5.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的菌种培养温度为56-60℃，菌种培养时间为12-16h。

6.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的菌种活化培养基按照质量百分比计组成为蛋白胨1％、牛肉浸出粉0.3％、氯化钠0.5％、蒸馏水余量，pH 7.2±0.2。

7.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的倒置培养温度为30-38℃，倒置培养时间为20-25h。

8.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的芽孢生长培养基按照质量百分比计组成为牛肉浸出粉0.2％、蛋白胨0.4％、葡萄糖0.1％、磷酸氢二钾0.2％、氯化锰0.2％、琼脂2％、蒸馏水余量，pH 7.2±0.2。

9.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的倒置培养温度为56-60℃，倒置培养时间为20-25h。

10.根据权利要求1所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的芽孢生长培养基按照质量百分比计组成为牛肉浸出粉0.2％、蛋白胨0.4％、葡萄糖0.1％、磷酸氢二钾0.2％、氯化锰0.2％、琼脂2％、蒸馏水余量，pH 7.2±0.2。

2

CN 105368746 A

说 明 书

嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法

1/3页

技术领域

[0001]

本发明属于微生物芽孢发酵技术领域，具体涉及一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制

备方法。背景技术

嗜热脂肪芽孢杆菌为需氧或者兼性厌氧菌，为革兰氏阳性菌，利用葡萄糖生长产酸不产气。最适生长繁殖温度为55-60℃，最高生长温度为65-75℃，属于嗜热菌。中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)收藏编号为：10267，即ATCC：7953。[0003] 嗜热脂肪芽孢杆菌所产芽孢无毒，无致病性，对热、放射线和化学物质有很强的抵抗力，尤其对压力蒸汽和过氧化氢的抗力强于大多数微生物，因此在我国、欧洲、美国等地作为热力灭菌和过氧化氢低温等离子灭菌的标准菌株，另外该菌还经常用来检测抗生素的残留等。鉴于嗜热脂肪芽孢杆菌所产芽孢的特性，在消毒灭菌监测领域得到广泛的应用。[0004] 在加工生产中嗜热脂肪芽孢杆菌快速大量的形成稳定芽孢状态关系到整个生产及其后其保存使用的效果，其中如何提高嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢生成率显得尤为重要，所以确定一种快速有效的促进嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢形成的方法是十分必要的。

[0002]

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，操作简便、缩短了

发酵时间、降低了生产成本、提高了使用效果。

[0006] 本发明所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，步骤如下：[0007] (1)菌种热激：菌种在水浴中加热；[0008] (2)菌种活化：在菌种活化培养基上进行菌种培养；[0009] (3)菌种冷刺激：将活化好的菌种在-10－-20℃放置1-2h；[0010] (4)一级培养：在芽孢生长培养基上倒置培养；[0011] (5)二级培养：在芽孢生长培养基上倒置培养，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。[0012] 步骤(1)中所述的水浴温度为50-60℃。[0013] 步骤(1)中所述的加热时间为4-6h。

66

[0014] 步骤(1)中所述的菌种用无菌水稀释到浓度为1×10-3×10cfu/ml。[0015] 步骤(2)中所述的菌种培养温度为56-60℃，菌种培养时间为12-16h。[0016] 步骤(2)中所述的菌种活化培养基按照质量百分比计组成为蛋白胨1％、牛肉浸出粉0.3％、氯化钠0.5％、蒸馏水余量，pH 7.2±0.2，其灭菌条件为121℃灭菌20-30min。[0017] 步骤(4)中所述的倒置培养温度为30-38℃，倒置培养时间为20-25h。

[0018] 步骤(4)中所述的芽孢生长培养基按照质量百分比计组成为牛肉浸出粉0.2％、蛋白胨0.4％、葡萄糖0.1％、磷酸氢二钾0.2％、氯化锰0.2％、琼脂2％、蒸馏水余量，pH 7.2±0.2，其灭菌条件为115℃灭菌30min。

[0005] [0019]

步骤(5)中所述的倒置培养温度为56-60℃，倒置培养时间为20-25h。

3

CN 105368746 A[0020]

说 明 书

2/3页

步骤(5)中所述的芽孢生长培养基按照质量百分比计组成为牛肉浸出粉0.2％、蛋白胨0.4％、葡萄糖0.1％、磷酸氢二钾0.2％、氯化锰0.2％、琼脂2％、蒸馏水余量，pH 7.2±0.2，其灭菌条件为115℃灭菌30min。

[0021] 活化后的菌种经过-10－-20℃的冷刺激后再接种到芽胞生长培养基上会提高芽胞生成的速率和比率。

[0022] 本发明所述的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的制备方法，具体步骤如下：[0023] (1)将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株溶解到去离子水中，制作成菌悬液，调节菌悬液菌种的浓度为1×106-3×106cfu/ml。将溶解好的菌悬液置于50-60℃的水浴中，加热4-6h。[0024] (2)将经过热激的菌种接种到菌种活化培养基中，56-60℃静止培养12-16h。[0025] (3)将活化好的菌种放置到-10－-20℃条件下放置1-2h，然后放置到室温。[0026] (4)一级培养：将处理好的菌液接种到芽孢生长培养基中，30-38℃条件下静止正置1h，然后静止倒置培养24h。[0027] (5)二级培养：将一级培养后的芽孢生长培养基，56-60℃静止培养20-25h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。

[0028] 嗜热脂肪芽孢杆菌菌株优选中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)ATCC：7953。

[0029] 芽孢的转化率可通过对得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用芽孢染色法染色获得，芽胞呈绿色，没有形成芽孢的菌体呈红色。[0030] 本发明中所用的芽孢染色法为：用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上；将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的质量浓度5.0％孔雀绿水溶液；将平皿盖好，放-56℃条件下，加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液；加质量浓度0.5％沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。[0031] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：[0032] 本发明根据嗜热脂肪芽孢杆菌的特点，采用热激、活化、冷刺激和逐级培养的手段，使该芽孢杆菌能够在发酵的过程中快速形成芽孢，缩短发酵时间，降低生产成本，提高使用效果；而且工艺简单、成本低廉，具有可操作性强的优点。[0033] 本发明通过改进培养基的配方以及培养的工艺，可有效地提高芽孢的生成率，得到大批量的芽孢。而且培养基的原料价格低廉，工艺流程相对简单，生产周期短，整个培养工艺一批次耗时大约72h，本发明提供了一种可以使芽孢的生产工业化发酵的路线，芽孢的转化率大于等于98％，可一次获得含量≥1×109cfu/ml的芽孢。具体实施方式

[0034] 以下结合实施例对本发明做进一步描述。[0035] 实施例1

[0036] (1)将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株溶解到去离子水中，制作成菌悬液，调节菌悬液菌种的浓度为1×106cfu/ml。将溶解好的菌悬液置于50℃的水浴中，加热4h。(2)将经过热激的菌种接种到菌种活化培养基中，56℃静止培养12h。[0038] (3)将活化好的菌种放置到-20℃条件下放置1h，然后放置到室温。[0039] (4)一级培养：将处理好的菌液接种到芽孢生长培养基中，35℃条件下静止正置

[0037]

4

CN 105368746 A

说 明 书

3/3页

1h，然后静止倒置培养24h。[0040] (5)二级培养：将一级培养后的芽孢生长培养基，56℃静止培养20h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。

[0041] 对上述得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用芽孢染色法染色，芽胞的形成率为98％。[0042] 实施例2

[0043] (1)将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株溶解到去离子水中，制作成菌悬液，调节菌悬液菌种的浓度为1×106cfu/ml。将溶解好的菌悬液置于55℃的水浴中，加热5h。[0044] (2)将经过热激的菌种接种到菌种活化培养基中，58℃静止培养14h。[0045] (3)将活化好的菌种放置到-15℃条件下放置1.5h，然后放置到室温。[0046] (4)一级培养：将处理好的菌液接种到芽孢生长培养基中，30℃条件下静止正置1h，然后静止倒置培养24h。[0047] (5)二级培养：将一级培养后的芽孢生长培养基，56℃静止培养23h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。

[0048] 对上述得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用芽孢染色法染色，芽胞的形成率为99％。[0049] 实施例3

[0050] (1)将嗜热脂肪芽孢杆菌菌株溶解到去离子水中，制作成菌悬液，调节菌悬液菌种的浓度为3×106cfu/ml。将溶解好的菌悬液置于60℃的水浴中，加热6h。[0051] (2)将经过热激的菌种接种到菌种活化培养基中，60℃静止培养16h。[0052] (3)将活化好的菌种放置到-10℃条件下放置2h，然后放置到室温。[0053] (4)一级培养：将处理好的菌液接种到芽孢生长培养基中，38℃条件下静止正置1h，然后静止倒置培养24h。[00] (5)二级培养：将一级培养后的芽孢生长培养基，60℃静止培养25h，得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。

[0055] 对上述得到的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢用芽孢染色法染色，芽胞的形成率为98％。

5