一种产L-乳酸的菌株及用该菌同步糖化发酵菊芋生产L-乳酸的方法[

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200810235365.7

[51]Int.CI.

C12N 1/20 (2006.01)C12P 39/00 (2006.01)C12P 7/56 (2006.01)C12R 1/225 (2006.01)

[43]公开日2009年4月29日[22]申请日2008.12.08[21]申请号200810235365.7

[71]申请人江南大学

地址214028江苏省无锡市新区新华路94号江南

大学国家大学科技园[72]发明人张伟国 钱和 葛向阳

[11]公开号CN 101418272A

[74]专利代理机构无锡市大为专利商标事务所

代理人时旭丹 刘品超

C12R 1/685 (2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 4 页

[54]发明名称

一种产L－乳酸的菌株及用该菌同步糖化发酵菊芋生产L－乳酸的方法[57]摘要

一种产L－乳酸的菌株及用该菌同步糖化发酵菊芋生产L－乳酸的方法，属于生物能源与转化技术，酶与代谢调控技术，以及相关的发酵工程技术领域。本发明使用黑曲霉和乳酸菌采用同步糖化与发酵的新工艺转化菊芋为L－乳酸。从自然界中得到一株高菊粉酶活力的黑曲霉菌株SL－09和一株产高光学纯度L－乳酸的乳酸菌G－02，当这两株菌混合培养时，由于存在明显的协同作用，使黑曲霉菊粉酶活力得到显著提高，在乳酸发酵工艺中，使用菊芋粉作为底物，采用补料发酵工艺，经36h的发酵，得到了L－乳酸浓度120.5g/L，将转化率提高到94.5％。本发明对转化菊芋为乳酸的工业化提供了依据。

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权 利 要 求 书

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1、一种产L-乳酸的菌株，其分类命名为酪乳酸菌(Lactobacillus sp.)G-02，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208232。 2、用权利要求1所述菌株同步糖化发酵菊芋生产L-乳酸的方法，其特征是使用具备较高菊粉酶活力的黑曲霉SL-09，在发酵进行12h后，接入酪酪乳酸菌G-02，然后采用同步糖化与发酵的工艺，步骤为： (1)菊芋粉的制备：

将新鲜菊芋根茎洗净、切片，40℃通风干燥48h，风干的菊芋片采用粉碎机打磨，细粉过50目筛；干粉含总糖量为56％； (2)酪乳酸菌种子的制备：

酪乳酸菌种子培养基组成以g/L计为：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母膏10，(NH4)2HPO4，2，MnSO4·H2O 0.2，CaCO3，20，初始pH 7.0；将一环酪乳酸菌G-02种子接入100mL灭菌的培养基中，30℃、140r/min一级摇瓶培养18h后，将6只一级培养液分别接入6只装有3L培养基的5L平底圆烧瓶中，继续二级培养30h；

(3)黑曲霉的产酶：

产酶培养基组成以g/L计为：菊芋粉50，豆饼粉40，蔗糖酯6； 将黑曲霉株SL-09接入装有20L产酶培养基的50L发酵罐中，30℃、通风量0.8L/min、转速140r/min，在发酵进行12h后接入酪乳酸菌，即将所得6只二级培养液接入，产酶进程中无需调节pH，总培养时间60h后，产菊粉酶内切酶和外切酶分别达到275.6U/ml和571.8U/mL，所得菊粉酶液用于产L-乳酸；

(4)同步糖化与发酵产L-乳酸：

由步骤(3)所得菊粉酶液加水、加底物菊芋粉组成发酵液，同步糖化与发酵菊芋生产乳酸的菊粉酶接种量和酶活分别为35％和50U/mL，在发酵的开始、12h和24h时，分别将40Kg、25Kg和25Kg的菊芋粉加入400L发酵液中，发酵温度30℃，总发酵时间36h后发酵终止，乳酸浓度为120.5g/L，转化率为理论转化率的94.5％。

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说 明 书

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一种产L-乳酸的菌株及用该菌同步糖化发酵菊芋生产L-乳酸的方法

技术领域

一种产L-乳酸的菌株及用该菌同步糖化发酵菊芋生产L-乳酸的方法，属于生物能源与转化技术，酶与代谢调控技术，以及相关的发酵工程技术领域。背景技术

乳酸作为一种常用的基础原料，被广泛地应用于食品、化妆品、药品、纺织和化学工业中；为了提高乳酸产量、降低成本，国内外研究工作者在生产菌株和发酵工艺上做了大量的工作。近年来，生物可降解聚合乳酸的大量需求，较大地促进了发酵法生产L-乳酸的发展。

菊芋(又名洋姜，鬼子姜、毛子姜)是菊科向日葵属一年生或多年生草本植物。我国南北各地现均有种植，而且种植面积正逐步扩大。该植株不但营养丰富，耐寒，耐沙漠，耐盐碱，抗病虫害而且一次种植终生收益，繁殖力强并能较好地生长在极其贫瘠的土地上，生产过程不需管理。菊芋的块茎富含氨基酸、糖分、维生素等。菊芋的根系发达茎叶茂盛，可以防风固沙，防止水土流失，美化、净化环境，维护生态平衡。它适应性强，生产成本低，产品用途广，社会、经济、生态效益显著。因地制宜地种植与综合开发利用菊芋，其发展前景十分可观。所以近年来在国内外受到普遍的关注。鲜菊芋块茎的水分含量在70％左右，总糖含量为20％左右，多年来该作物一直被作为生产乙醇的看好原料。而开发菊芋生产乳酸的研究尚未见报道。

菊芋的主要成分是菊粉，为乳酸菌所不能利用的多聚果糖，所以开发菊芋原料生产乳酸的首要条件就是菊粉酶的合成。能够合成菊粉酶的微生物有许多种，由于其自身粗放的生长需求和广泛的水解酶系，黑曲霉被普遍应用于糖化酶制剂工业。研究表明，菊粉酶是一种诱导酶，而且该酶的合成受到葡萄糖的抑制，因此为了进一步提高菊粉酶的活性，必须尽可能地降低发酵液中葡萄糖的浓度。发明内容

本发明的目的是提供一种产L-乳酸的菌株及用该菌同步糖化发酵菊芋生产L-乳酸的方法。为了最大程度地降低菊芋发酵生产乳酸的成本，提高生产强度和转化率，同时提高发酵醪最终乳酸浓度，本发明采用本实验室筛选得到的高L-乳酸光学纯度酪乳酸菌，将该菌与本实验室具备独立知识产权的黑曲霉SL-09【World J Microbiol Biotechnol(2008)24：133-138DOI 10.1007/s1274-007-9450-3】进行混合培养，大幅度地提高了菊粉酶活性；然后在乳酸发酵工艺中

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使用同步糖化与发酵工艺，并对该工艺发酵工艺参数进行了优化，而且在整个发酵过程中无需添加无机盐。由于在发酵过程中糖的浓度始终保持在较低的水平，使酶活和酪乳酸菌发酵活力都得到了充分的发挥，经36h发酵，L-乳酸浓度达到120.5g/L，同时达到了94.5％的转化率。

本发明的技术方案：一种产L-乳酸的菌株，其分类命名为酪乳酸菌(Lactobacillus sp.)G-02，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208232。

用所述菌株同步糖化发酵菊芋生产L-乳酸的方法，使用具备较高菊粉酶活力的黑曲霉SL-09，在发酵进行12h后，接入酪乳酸菌G-02，然后采用同步糖化与发酵的工艺，步骤为： (1)菊芋粉的制备：

将新鲜菊芋根茎洗净、切片，40℃通风干燥48h，风干的菊芋片采用粉碎机打磨，细粉过50目筛；干粉含总糖量为56％； (2)酪乳酸菌种子的制备：

酪乳酸菌种子培养基组成以g/L计为：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母膏10，(NH4)2HPO4，2，MnSO4·H2O 0.2，CaCO3，20，初始pH 7.0；将一环酪乳酸菌G-02种子接入100mL灭菌的培养基中，30℃、140r/min一级摇瓶培养18h后，将6只一级培养液分别接入6只装有3L培养基的5L平底圆烧瓶中，继续二级培养30h；

(3)黑曲霉的产酶：

产酶培养基组成以g/L计为：菊芋粉50，豆饼粉40，蔗糖酯6；将黑曲霉株SL-09接入装有20L产酶培养基的50L发酵罐中，30℃、通风量0.8L/min、转速140r/min，在发酵进行12h后接入酪乳酸菌，即将所得6只二级培养液接入，产酶进程中无需调节pH，总培养时间60h后，产菊粉酶内切酶和外切酶分别达到275.6U/ml和571.8U/mL，所得菊粉酶液用于产L-乳酸，该菊粉酶液不但配置方便，而且具有较强的来自农作物本身的缓冲体系； (4)同步糖化与发酵产L-乳酸：

由步骤(3)所得菊粉酶液加水、加底物菊芋粉组成发酵液，同步糖化与发酵菊芋生产乳酸的菊粉酶接种量和酶活分别为35％和50U/mL，为了最大程度地降低高浓度糖对酪乳酸菌活力的抑制作用，同时提高糖对乳酸的转化率，采用分批添加底物的补料策略，在发酵的开始、12h和24h时，分别将40Kg、25Kg和25Kg的菊芋粉加入400L发酵液中，发酵温度30℃，总发酵时间36h后发酵终止，乳酸浓度为120.5g/L，转化率为理论转化率的94.5％。 本发明的有益效果：菊芋现在的市售价格和薯干基本相当(鲜菊芋为300～500元/吨)，其种植面积正以近20％的速度逐年递增，所以转化菊芋为乳酸，无

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论对解决三农问题还是维护生态环境问题都有着深远的社会和经济意义。 从自然界中得到一株同型发酵酪乳酸菌，其产L(+)-乳酸的光学纯度达到95％。该株酪乳酸菌在与黑曲霉共培养的工艺中，由于两株菌存在协同作用，使黑曲霉产酶水平得到较大幅度提高。研究表明酪乳酸菌加入时间在12h时，黑曲霉产菊粉酶活力最高，经60h培养，菊粉酶内切酶和外切酶活力分别达到275.6和571.8U/mL。

而后对采用菊芋粉直接生产乳酸的同步糖化与发酵工艺进行了优化，酪乳酸菌接种量、酶活量对乳酸发酵强度影响显著，而菊芋粉浓度对乳酸浓度和转化率影响显著。研究表明最佳接种量、酶活量和菊芋粉浓度分别为35％，50U/mL和230g/L。采用以菊芋粉为底物的补料同步糖化与发酵工艺，避免了存在于发酵工艺中的底物抑制现象，较大地提高了整体乳酸生产强度和转化率。经36h发酵，发酵液乳酸浓度达到120.5g/L，转化率达到94.5％。 本发明的特点为：

1.自行筛选得到L(+)-乳酸光学纯度达到95％的酪乳酸菌G-02，该菌株在与黑曲霉SL-09共培养的工艺中，存在显著的协同作用，使培养基总糖迅速下降，黑曲霉产菊粉酶内切酶和外切酶活力都得到显著提高。

2.首次对同步糖化与发酵菊芋生产乳酸工艺中酪乳酸菌接种量、酶活量和底物浓度对发酵强度和转化率的影响进行探索，发现在同步法利用菊芋发酵生产乳酸中，过高的酶活量和底物浓度对乳酸发酵的转化率有显著降低的作用。 3.首次采用补料同步糖化与发酵工艺，以菊芋粉为底物生产L-乳酸，避免了发酵醪中糖的抑制作用。发酵在36h被终止，最终发酵醪乳酸含量为120.5g/L，转化率为94.5％。 生物材料样品保藏

一种产L-乳酸的菌株，其分类命名为酪乳酸菌(Lactobacillus sp.)G-02，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008年11月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 208232。 具体实施方式 实施例1：

将新鲜菊芋根茎洗净、切片，40℃通风干燥48h，风干的菊芋片采用粉碎机打磨，细粉过50目筛；干粉含总糖量为56％。

酪乳酸菌种子培养基组成以g/L计：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母膏10，(NH4)2HPO4，2，MnSO4·H2O 0.2，CaCO3，20，初始pH 7.0；将一环酪乳酸菌G-02种子接入100mL灭菌的培养基中，30℃、140r/min一级摇瓶培养18h后，将6只一级培养液分别接入6只装有3L培养基的5L平底圆烧瓶中，二级培养30h。

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产酶培养基组成以g/L计为：菊芋粉50，豆饼粉40，蔗糖酯6。 将黑曲霉株SL-09接入装有20L产酶培养基的50L发酵罐中，30℃、通风量0.8L/min、转速140r/min，在发酵进行12h后接入酪乳酸菌，即将所得6只二级培养液接入，产酶进程中无需调节pH，总培养时间60h后，产菊粉酶内切酶和外切酶分别达到275.6U/ml和571.8U/mL，所得菊粉酶液用于产L-乳酸。

所得菊粉酶液加水、加底物菊芋粉组成发酵液，同步糖化与发酵菊芋生产乳酸的菊粉酶接种量和酶活分别为35％和50U/mL，在发酵的开始、12h和24h时，分别将40Kg、25Kg和25Kg的菊芋粉加入400L发酵液中，发酵温度30℃，总发酵时间36h后发酵终止，乳酸浓度为120.5g/L，转化率为理论转化率的94.5％。

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