中围组织工程研究与临床康复 ７４誊 ６ ２０１０—０２—０５出版 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ５，２０１０ ＶｏＬ１４，Ｎｏ．６ 贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证木术★ 张岩，陈曦海，纪艳超，翟哲，吴波 Ｅｆｆｅｃｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ／ｎ ｖｉｔｒｏ Ｚｈａｎｇ Ｙａｈ，Ｃｈｅｎ Ｘｉ－ｈａｉ，Ｊｉ Ｙａｎ—ｃｈａｏ，Ｚｈａｉ Ｚｈｅ，Ｗｕ Ｂｏ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｆｏｕｒｔｈ ＨｏｓｐｉｔａＩ ｏｆ Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ Ｚｈａｎｇ Ｙａｎ★．Ｍａｓｔｅｒ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ， ＦｏｕｒｔｈＨｃｅｐｉｔａＩ ｏｆ Ｈａｒｂｉｎ ＭｅｄｉｃａＩ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｔｏ： Ｗｕ Ｂｅ，Ｍａｓｔｅｒ， Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ， Ｄｅｐａ＾ｒｎｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ， ＦｏｕｒｔｈＨｏｓｐｉｔａＩｏｆ Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１．Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ ｊｂｊｓｂｒ＠１２６．ｃｏｍ Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ：ｔｈｅ Ｔａｃｋｌｅ Ｋｅｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ。Ｎｏ ＧＣ０９Ｃ４０９－１ ： ＥｄｕｃａｔｉｏｎａＩ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨｅｉｌｏｎｇＪｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｎｏ １１５４１１４７＊ Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２００９．１１－２０ Ａｃｃｅｐｔｄｅ：２０１０－０１－０９ １００６ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：Ａ ｓｉｎａｉｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｒｒ ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ，ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｄｒｏｐ ｗｉｔｈ ａｇｅ． ０ＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｄｖｅｄ ＭＳＣｓ． ＭＥＴＨ０ＤＳ：Ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ，ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒＯｍ ｆｅｍｕｒ ａｎｄ ｔｉｂｉａ ｏｆ ａｒｔｓ。ｃｕｌｔｕｒｄｅ ｂｙ ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ．ｐｌａｃｅｄ ｊｎ ａｎ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５％ＣＯｚ ａｌ ３７℃．１１１ｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｒｅｎｅｗｅｄ ａｆｔｅｒ ２４ ｈｏｕｒｓ。ａｎｄ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｈａｎｇｅ ｗｉｔｈ ｏｎｃｅ ｐｅｒ ｗｅｅｋ．Ｔｈｅ ｗｅａｋｌｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐａｓｓａｇｅｄ．Ｔｈｅ ａｃｌＩ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌＩ－ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｄｅ ｂｙ ｌｆｏｗ ｃｖＩＯｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉａｃｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ． ＲＥＳＵＬＴＳ ＡＮＤ ＣＯＮＣＬＵＳｌ０Ｎ：Ａｆｔｅｒ ２４ ｈｏｕｒｓ ｆｏ ｃｕｌｔｕｒｅ。ｔｈｅ ａｃｌｌｓ ｃｏｕｌｄ ａｄｈｅｒｅ ｔｏ ｔｈｅ ｗａｌｌｓ ｗｉｔｈ ｆｕｓｉｆ（帅ｏｒ ｔｒｉａｎｇｌｅ ｓｈａｐｅｓ。 ｐｒｏｌ№ｒａｔｄｅ ｆａｓｔｅｒ ａｆｔｅｒ ２—３ ｄａｙｓ．ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔｄｅ ｗｈｉｌｒｐｏｏｌ－ｌｉｋｅ ｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅａｃｈｅｄ ａ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ａｆｔｅｒ ２ ｄａｙｓ。ａｎｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｌａｔｅ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ａｆｔｅｒ １ ２ ｄａｙｓ．ｗｈｉｈｃ ｃｏｖｅｒｄｅ ｔｈｅ ｂｏｔＵｅ ａｆｔｅｒ １ ５ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｄｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉＵｖｅ ｔｏ ＣＤ９０ ａｎｄ ＣＤ５４．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｖｅｄｆｉｄｅ ｔｈａｔ ｂｏｎｅ ｍａ￣ｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＭＳＣｓ ａｃｎ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｄｅ ｂｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍ猷ｈｏｄ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｅｓｙ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃａｎ ｍａｉｎｔａｉｎ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ． Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｃｈｅｎ ＸＨ，Ｊｉ ＹＣ，Ｚｈａｉ Ｚ，Ｗｕ Ｂ．Ｅｆｆｅｃｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ ｙｕ Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎ￣ｕ．２０１０；１４（６）：１００６・１００８． 【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｃｎ ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】 摘要 背景：骨髓中的间充质干细胞含量不高，且随着年龄增加或体质衰弱，骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少。 目的：验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果。 方法：大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，用含小牛血清的ＤＭＥＭ培养基冲洗骨髓腔，收集骨髓细 胞，反复吹打制成单细胞悬液，接种后置于３７℃、体积分数为５％的ＣＯ２培养箱内孵育，２４ ｈ后全量换液，以后每周全量 换液１次，筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养。观察细胞形态，绘制细胞生长曲线，流式细胞仪及免疫细胞化学染 色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达。 结果与结论：培养２４ ｈ后细胞能够贴壁生长，呈梭形或三角形；第二三天贴壁细胞迅速增殖；培养１５ ｄ左右出现致密的贴 壁细胞层，呈漩涡状生长或成簇生长。细胞在接种后２ ｄ进入对数生长期，１２ ｄ左右进入平台期，约１５ ｄ细胞可铺满瓶底。 分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞ＣＤ９０和ＣＤ５４均呈阳性表达。结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间 充质干细胞，操作简单，造成污染的环节和机会较少，不需离心，可以更好的保持细胞活性。 关键词：分离：培养；贴壁法；大鼠；骨髓间充质干细胞；干细胞 ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７３—８２２５．２００９．０６．０１１ 张岩，陈曦海，纪艳超，翟哲，吴波．贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康 复，２０１０，１４（６）：１００６—１００８． 【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ ｈ￣ｐ：ｌｆｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】 脑损伤的修复机制，实验尝试从成年大鼠骨髓 ０引言 中分离培养和鉴定骨髓间充质干细胞。 近年来研究表明，骨髓间充质干细胞在特 １材料和方法 定条件下可分化为多种组织谱系的细胞ｒ 】，包 括脂肪细胞、成肌纤维细胞、成骨细胞、神经 设计：细胞学体外观察。 细胞等。由于骨髓问充质干细胞不但可在特定 时间及地点：于２００７—０８／２００８一Ｏ８在哈尔 条件下分化为神经细胞，还具有取材方便、扩 滨医科大学动物实验中心完成。 增迅速、无免疫原性、可自体移植等特点，故 材料：２－４月龄雌性ＳＤ大鼠４０只，体质量 其在脑损伤修复和细胞治疗等方面具有广阔的 ２００－３００ ｇ，由哈尔滨医科大学实验动物中心 应用前景 。 提供，动物质量合格证号２００８Ｄ２１１，实验过 为进一步探讨骨髓问充质干细胞移植治疗 程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 ＲＯ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｃｎ．ｚｇｌｃｋ￣，ｃｏｍ ｗ ｃ尺矾ｏｒｇ Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ 图３骨髓间充质干细胞的生长曲线 ３讨论 目前组织和细胞移植被公认为是治疗中枢神经系 统损伤最有希望的方法之一Ｉ］ ，但无论是胚胎组织、周 围神经，还是神经干细胞、嗅鞘细胞，不仅存在取材和 体外培养增殖困难等问题，而且还受到法律和伦理的制 约【１Ⅲ】。由于骨髓问充质干细胞不但可在特定条件下分化 为神经细胞，还具有取材方便、扩增迅速、无免疫原性、 可自体移植等特点，己成为中枢神经系统损伤修复和细 胞治疗等方面研究的热点【 Ｊ。 实验采用贴壁分离法体外培养骨髓问充质干细胞， 经流式细胞仪检测细胞表面分子表达和分离效果良好， 结果表明运用贴壁分离法操作简单，造成污染的环节和 机会较少，不需离心，可以更好的保持细胞的活性状态。 接种培养后第２天可观察到部分细胞贴壁，造血系干细 胞及状态不好无法贴壁的细胞、细胞崩解的碎片仍然悬 浮在培养基中。接种２４ ｈ后换液，每天可观察到贴壁细 胞增多，且快速增殖、积聚，细胞呈梭形，团簇性生长 倾向。至１２－２１ ｄ时培养瓶中的细胞铺满瓶底，悬浮造 血细胞及死亡细胞已基本去除，然后细胞就可进行传代 培养。实验中观察到骨髓问充质干细胞在体外培养条件 下生长状况与其他细胞一样，经历生长潜伏期、对数增 殖期和生长平台期。有人对常规培养条件下骨髓问充质 干细胞生长增殖进行观察，也发现成人骨髓间充质干细 胞可以在体外分裂３８次左右，并且保持纺锤形态和成骨 潜能，直至细胞衰竭【］ 。细胞进行冷冻复苏后培养可传 代达１ ５次，细胞的增殖分化潜能未受影响。但有研究认 为，过多传代培养会降低细胞的功能，甚至出现骨髓问 充质干细胞的凋亡。 骨髓问充质干细胞的体外扩增与种植密度关系密 切，有研究者发现人骨髓问充质干细胞传代时，以５ｘｌ０ 个／ｃｍ 的密度接种，大约２周后能扩增为３－５倍的单层， １００８ 张岩．等 贴壁法体癸分离培养大鼠肯髓闻充员干镪咆的效果验证 推测骨髓问充质干细胞细胞之间存在接触抑制 …。由于 细胞极低密度接种培养时获取大量细胞的时间会很长， 所以调整细胞接种浓度，在尽可能短的时间内获得大量 细胞尤为重要。实验原代培养时采用的细胞浓度为 １×１０ ，证实是一种较为合适的接种密度。由于取材 及分离方法不同，此浓度应随情况的改变而作出调整。 典型的骨髓问充质干细胞形态与细胞密度有关。当以低 密度种植时大部分细胞大而扁平，部分细胞为小的梭形 或圆形；当细胞接近铺满瓶底时，其形态即呈梭形的成 纤维细胞样。 总之，贴壁分离法分离培养骨髓间充质干细胞是一 种简单、有效的好方法，骨髓问充质干细胞具有强大的 扩增能力，并且细胞形态和生物学特性稳定性好，其体 外扩增速度与种植密度关系密切，应根据取材以及分离 方法不同调整细胞接种密度。 ４参考文献 『１１ Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ ＡＪ，Ｇｅｎｋａｉａ ＪＦ，Ｋｕｌａｇｉｎａ ＮＮ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｉｎ ｎＯｎ１１Ｉ ａｎｄ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｏｒｇａｎｓ．Ｅｘｐ Ｈａｅｍａｔｏ１． １ ９７６；４（５）：２６７—２７４． 『２１ Ｒｖｄｅｎ Ｍ，Ｄｉｃｋｅｒ Ａ，Ｇｏｔｈｅｒｓｔｒ０ｍ Ｃ，ｅｔ ａＩ ＦｕｃｔｉｏｎａＩ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａＩ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｎｖｅｄ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３；３１ １ ｆ２）：３９１—３９７． 『３１ Ｄｉｒｅｋｚｅ ＮＣ，Ｆｏｒｂｅｓ ＳＪ，Ｂｒｉｔｔａｎ Ｍ，ｅｔ ａＩ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｂｙ ｂｏｎｅ－ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｙｏｆｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｂｏｎｅ－ｍａｒｒｏｗ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｍｉｃｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００３；２１（５）：５１４—５２０． ｆ４１ Ｍｉｌｌｅｓｉ Ｈ．Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｃｈｉａＩ ｐｌｅｘｕｓ Ｉｅｓｉｏｎｓ．Ｈａｎｄｃｈｉｒ Ｍｉｋｒｏｃｈｉｒ Ｐｌａｓｔ Ｃｈｉｒ．２００４；３６（１１：２９－３６． 『５１ Ｍｉｌｌｅｓｉ Ｈ．Ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ：ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ Ｓｕｐｐ１．２００７；１００：３７—３８． 『６１ Ｍｉｌｌｅｓｉ Ｈ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ｈａｎｄ Ｃｌｉｎ．２０００；１ ６（１）： ７３—９１． ｆ７１ Ｏｕｒｅｄｎｉｋ Ｖ，Ｏｕｒｅｄｎｉｋ Ｊ，Ｐａｒｋ ＫＩ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ—ａ ｖｅｒ－ｓａｔｉｌｅ ｔｏｏＩ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒ－ｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．１ ９９９；５６：２６７—２７８． 『８１ Ｋｏｄａ Ｍ．Ｏｋａｄａ Ｓ。Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａ１．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌＩ ａｎｄ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００５；１６（１６１：１７６３—１７６７． 『９１ Ｗａｎｇ Ｐ Ｐ＇Ｗａｎｇ ＪＨ，Ｙａｈ Ｚ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏ￣ｐｅｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａＩ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ＨＧＦ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００４；３２０（３）：７１ ２－７１ ６． 『１０１ Ｈａｓｓａｎ Ｈ 日．Ｓｈｅｅｍｙ Ｍ．Ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ－ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａＩｉｎｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ．２００４；９７ｆ１０）：４６５—４７１． 『１ １ １ Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｍ，Ｃｏｏｐｅｒ ＨＭ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｎｅｏｇｅｎｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｉｉｇａｎｄｓ Ｉｎ ＣＮＳ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００８：１０６（４）： １４８３—１４９２． ｆ１ ２１ Ｍｅｔｉｎ Ｃ，Ｄｅｌｅｇｌｉｓｅ Ｄ。Ｓｅｒａｆｉｎｉ ｅｔ ａ１．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｎｅｔｒｉｎ．１ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｒｔｉａｃＩ ｅｆｆｅｒｅｎｔｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１ ９９７；１ ２４：５０６３—５０７４． 『１ ３１ Ｂｒａｉｓｔｅｄ Ｊ Ｅ＿Ｎｅｔｒｉｎ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈａｌａｍｉｃ ａｘｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｐｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｅｃＩ ｐｒｏｉｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ＿２Ｏ００：２Ｏ：５７９２—５８０１． ［１ ４】Ｄｉｃｋｓｏｎ ＢＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｘｏｎ ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２；２９８：１ ９５． ［１５】 Ｋｅｌｅｍａｎ Ｋ，Ｄｉｃｋｓｏｎ ＢＪ．Ｓｈｏｒｔ－ａｎｄ ｌｏｎｇ—ｒａｎｇｅ ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｕｎｃ５ ｎｅｔｒｉｎ ｒｃｅｅｐｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｎ．２００１：３２：６０孓６１ ７． 『１ ６１ Ｃｏｌｅ ＳＪ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｄ，Ｃｏｏｐｅｒ ＨＭ．Ｎｅｃｇｅｎｉｎ：Ａ ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｄｉｖｅｒｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１．２００７；３９（９）：１５６９－１５７５． 『１ ７１ Ｗｉｌｓｏｎ ＮＨ，Ｋｅｙ Ｂ．Ｎｅｃｇｅｎｉｎ：ｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｍａｎｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ＣｅｌＩ Ｂｉｏ１．２０Ｏ７：３９（５）：８７４—８７８． 『１ ８１ Ｌｉｕ Ｇ Ｂｅｇｇｓ Ｈ。Ｊ￣ｒｇｅｎｓｅｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｔｒｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｆｏｃａＩ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ｓｒｃ ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅｓ ｆｏｒ ａｘｏｎ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４；７（１１ １：１２２２．１２３２． 『１９１ Ｌｉ Ｗ，Ｌｅｅ Ｊ，Ｖｉｋｉｓ ＨＧ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＡＫ ａｎｄ Ｓｒｃ ａｒｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｄｅ ｆｏｒ ｎｅｔｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４；７（１１）：１２１３－１２２１． 『２０１ ＤｅＩ Ｒｉｏ ＪＡ，Ｇｏｎｚ￣ｌｅｚ－Ｂｉｌｌａｕｌｔ Ｃ，ＵｒｅＳａ ＪＭ，ｅｌ ａ１．ＭＡＰ１ Ｂ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｎｅｔ＾ｎ １ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｘｏｎａＩ ｇｕｉｄａｎｃｅ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏ１．２００４；１４（１０）：８４０－８５０． ＰＯ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｃｎ．ｚｇ／ｃｋｆ，ｃｏｍ
