WB实验步骤

(1) 根据所需检测蛋白分子量的大小, 配制合适浓度的凝胶。

P53=53KD (1:1000), P21=21KD, Bcl2=28KD, Caspase3=17KD (1:1000)， GAPDH=36kDa (1:5000), β-actin=43kDa 50KD以下的分子量选用12%的分离胶(15ml)

试剂 蒸馏水 加样体积 4.0ml 作用 稀释 pH8.8与甘氨酸接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的泳动速度，从而使不同分子量的蛋白分开。 0.15(150ul) 0.15(150ul) 0.006ml(6ul) 使蛋白在胶中可以保持变性 催化剂 催化剂 30%丙烯酰胺溶液 6.0ml 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10% SDS 10%过硫酸氨(APS) TEMED 3.8ml 分离胶加至薄玻板下方约1cm, 分离胶的上方轻轻地来回均匀加蒸馏水，有助于将分离胶压平，1小时后将蒸馏水倒去，用滤纸吸干，准备加浓缩胶(积成胶)。 (2)聚丙烯酰胺浓缩胶(6ml):

试剂 蒸馏水 加样体积 4.1ml 作用 稀释 pH6.8可以通过甘氨酸和和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细。 0.6(60ul) 0.6(60ul) 0.006ml(6ul) 使蛋白在胶中可以保持变性 催化剂 催化剂 30%丙烯酰胺溶液 1.0ml 1.5 mol/L Tris (pH6.8) 10% SDS 10%过硫酸氨(APS) TEMED

0.75ml (3)等待胶凝固的过程中煮蛋白：在提取的蛋白质样品中加入5×SDS上样缓冲液（5×SDS上样缓冲液:蛋白上清液=1:4），100℃煮6min，瞬离，冰上静置备用，保存于-20℃。

2.电泳：向泳道中加入上述已加热变性的蛋白样品50μg, 同时在合适的泳道加入蛋白Marker。80V稳压运行40min后,再用 120V 稳压电泳至蛋白Loading Buffer移动到凝胶下缘(约55min)。要用大电泳仪，可以从80V浓缩胶自动转到120V跑分离胶。放板子的时候，高的厚玻璃板要放在外面一侧。

3.转膜：将转膜缓冲液置于-20°C冰箱预冷1小时，PVDF膜放入甲醇中浸泡30s后去离子水洗涤干净，转入转膜缓冲液中平衡5min。从黑面开始按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按正确顺序装入转膜夹后，将整个转膜系统置于冰上，100V稳压转膜1.5h (注意电流不要超过 300mA，以免发热过度)。

4.封闭：转膜结束后，取出PVDF膜。正面朝上，将其放入PBST配制的5%的脱脂牛奶中，置于摇床上封闭1h。封闭之前，可根据分子量大小将膜切开：在实验台上铺一层保鲜膜，包住PVDF膜，用尺对齐，然后将PVDF膜切开。

5.一抗孵育：按照抗体说明书，用5%的PBST配制的脱脂牛奶稀释抗体至所需浓度。在湿盒内滴加抗体稀释液，PVDF膜覆盖其上，于 4°C冰箱孵育过夜。第二天即可取出膜于PBST中洗涤，共三次，每次15min;

6.二抗孵育：按照一抗的种属来源选择合适的二抗，根据二抗说明书稀释其至合适浓度，同孵育一抗一样，将PVDF膜覆盖在二抗稀释液表面，置于37°C生化培养箱孵育1h。取出PVDF膜放入PBST中洗涤2次，PBS洗涤最后1遍(以避免膜上有泡沫)，每次15min;

7.发光显影：在膜上滴加适量ECL发光液，通过成像系统保存条带和白片，根据蛋白Marker的位置，确定目的条带。