提RNA方法-20160325终版

CTAB+试剂盒法

①CTAB

1) 将5ml提取液（CTAB）与β-巯基乙醇（5ml体系加150ul）加入离心管中，65℃水浴

10-20min。（因为β-巯基乙醇具有挥发性，加入样品前加入离心管中即可，不需太早加入）。

2) 研磨样品（加适量PVP），加入到上述离心管中，65℃水浴10-20min（在水浴过程中

需适时拿出摇晃，放气，使充分反应）。 3) 离心，12000rpm，4℃，10min，取上清。

4) 加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，12000rpm，4℃，10min离心，取上清。（溶

液分三层，取最上层液体，中间为蛋白质层膜，取时应保持离心管坚直，用小头吸以防吸入下层和膜层物体）。 5) 重复步骤④。

6) 加入等体积异丙醇，冰箱冷冻30min，12000rpm，4℃离心10min，取沉淀（异丙醇事

先放至冰箱冷冻）。

②试剂盒

1) 粗提物400uL DEPC 水溶体，合并。

2) 加入500uL Buffer RL+10uL DTT solution （混匀，12000rpm，4℃，5min）。

3) 取上清液加入450ul无水乙醇，混匀，加入RNA分离柱，每次体积<600ul，12000rpm，

1min，弃滤液。

4) 加入500ul Buffer RWA到RNA 分离柱，12000rpm，30sec，弃滤液。

5) 加600ul Buffer RWB到RNA 分离柱，12000rpm，30sec，弃滤液。（沿管壁加入）。 6) 重复⑤。

7) 再次离心，12000rpm，2min。

8) RNA 分离柱安置新1.5ml吸集管，于柱膜加入50-200ul RNAse-Free 水，静置5min 9) 12000rpm，2min，洗脱。 10) 检验。

CTAB配方：500ml

用DEPC水配，需按顺序加

XYZ

1) CTAB: 10g

2) EDTA.Na2.H2O ：0.7445g*5=3.7225g 3) Tris: 6.057g 4) PVP: 10g 5) NaCl: 40.95g

SSTE配方：500ml

1) NaCl： 29.22g 2) Feis-Hcl: 0.788g 3) SDS: 2.512—2.513g 4) EDTA: 0.146g

纯试剂盒法

1) 新鲜组织加液氮研磨，研磨成粉末状，样品（20-50mg）加入到含有450ul Buffer PE

的1.5ml灭菌管中，用移液反复1吹打直至崩裂，液中无明显沉淀 2) 12000rpm 4℃ 5min

3) 将上清液小心吸取到心得1.5ml灭菌管，加入上清液1/10 体积的Buffer NB（此时会

出现沉淀）振荡混匀 4) 12000rpm 4℃ 5min

5) 将上清液小心吸取到心得1.5ml灭菌管中，加入450Buffer RL（使用前确认已加入

50xDTT solution）加入9ul 50xDTT ，1ml Buffer RL 加20ul 50 xDTT ，用移液将溶液混合均匀。

6) 加入样品体积1/2的无水乙醇（此时方能出现沉淀）移液将溶液混匀

7) 立即将混合液（含沉淀）全部转移到RNA Spin Column 中（600ul 若>600ul 分批加

入）。

8) 12000rpm 1min 弃滤液

9) 加500ul Buffer RWA 12000rpm 30sec 弃滤液

10) 加600ul Buffer RWA 12000rpm 30sec 弃滤液（沿管壁加入）

XYZ

11) Dnase I 消化（可选择）

a. Dnase I 反应液配制

5ul 10x Dnase I Buffer+4ul Recombinant+Dnase I+41ul Rnase free d H20 到新1.5ml Rnase Free 管混合均匀。

b.向RNA Spin Column 膜加入50ul Dnase I 反应液，室温静置15min

C.向RNA Spin Column 膜加入350ul 的Buffer RWB,12000rpm,离心30sec，弃滤液 12) 加600ul Buffer RWB ,12000rpm,离心30sec,弃滤液

13) 将RNA Spin Column重新安置安置于2ml collection Tube 12000rpm 2min

14) 将RNA Spin Column安置于1.5ml 离心管（干净）在RNA Spin Column膜加入

50-200ul Rnase Free d H20 OR 0.1% DEPC 处理水，室温静置5min。 15) 12000rpm 2min

16) 若想提高RNA收量—膜加50-200ul Rnase Free d H20 OR 0.1 0.1% DEPC 水洗脱。

若想得到高浓度RNA-将洗脱液重新加回膜