鸡新城疫抗体滴度的检测

鸡新城疫抗体滴度的检测

（红血球凝集抑制法）

1 红细胞血凝与血凝抑制的原理

红细胞凝集的实质是红细胞膜上的特异性抗原(凝集原，agglutinogen)和相应抗体(凝集素，agglutinin)发生抗原抗体反应。当病毒的悬液中先加入特异性抗原，且这种抗原的量足以封闭病毒颗粒或其凝集素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其凝集素直接接触，这是红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制，也称为血凝抑制反应。新城疫病毒属于副黏病毒属，是最主要的红细胞凝集性病毒，具有神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，可使红细胞凝集。

2 实验材料

鸡新城疫抗原(NDV，南京天邦生物科技有限公司)；生理盐水；肝素钠；96 孔 V 型微量血凝板；微量移液

3 红细胞凝集

3.1 1%鸡红细胞悬液的制备

取无免疫过的成年公鸡，翅静脉采血 10~15 mL，肝素抗凝，2000 r/min 离心 10 min，弃上清，注意要将血细胞泥表面的一层薄膜洗净。然后用血细胞泥 5~10 倍的PBS洗涤，2000 r/min 离心 10 min，弃上清，如此反复洗涤 3 次至上清液透明，弃上清液

后得到红细胞泥。再用PBS配成 1%鸡红细胞悬液（红细胞泥：PBS=1ml:100ml）。4℃保存，不超过5d。

3.2 红细胞凝集(4 单位抗原的滴定)

在 96 孔微量血凝板上，从左到右每空各加 50 μL 生理盐水，另加一排作为重复。再向每排的第 1 孔加入 50 μL 新城疫抗原，依次向后倍比稀释直至第 11 孔，第 12 孔作为对照，无抗原液。然后向每孔加入 1%鸡红细胞悬液 50 μL，将微量板振荡混匀 20~30

次（于微型振荡器上震荡1 m in），置于 37℃温箱感作 30 min 后每 5 min 观察一次，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果。

结果观察：将反应板倾斜 45 度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动着为沉淀，表明红细胞未被凝集或不完全被病毒凝集；如果红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。以 100%凝集的抗原最大稀释孔位该抗原的血凝价，即 1 个凝集单位；从该孔向前移 2 孔的抗原稀释度作为 4 单位抗原的稀释度。

抗原应稀释的倍数=血凝滴度÷4 (若血凝价为 26，病毒抗原应稀释倍数为 24（16），即16ml生理盐水+1ml抗原即为 4个单位血凝单位的病毒抗原)。

4 红细胞凝集抑制

在 96 孔微量血凝板上，从左到右每孔中各加 50 μL 生理盐水，再向每排的第 1 孔加入 50 μL 待测血清，依次向后倍比稀释直到第 10 孔，然后向每孔加入 50 μL 4 单位抗原，振荡混匀 20~30 次，置于 37℃温箱感作 20 min。取出再向每孔中加入 1%鸡红细胞悬液 50 μL，振荡混匀 20~30 次，置于 37℃温箱感作 20 min 后每 5 min 观察一次。

结果判定：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度，用被检血清最大稀释度的倒数或以 2 为底的对数(log2)表示，如某份血清的最高血凝抑制稀释度为 1:128，则该血清的 HI 抗体滴度为 128 或 7(log2)。当鸡的血清 HI 抗体滴度超过1000 时，可判定为新城疫感染。