第２６卷第１期 ２０ １ ０年１月 吉林工商学院学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＪＩＬＩＮ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬ０ＧＹ ＣＯＬＬＥＧＥ ＶＯ１．２６．Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２０ｌ０ 口应用技术研究 高压液相色谱法同步分析抗碱植物体内 有机酸组分和脯氨酸的研究 郭立泉，张浩东，魏贞伟，韩 丹 （吉林工商学院生物工程分院，吉林长春１３００６２） ［摘要】研究了同步分析抗碱植物星星草体内有机酸组分和脯氨酸含量的高压液相色谱法。实验结果表明：采用反相 液相色谱法（ＲＰ．ＨＰＬＣ），使用Ｃ１８柱；以０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍｍｏｌ・Ｌ一１四丁基硫酸氢铵（ＴＢＡ）（ｐＨ ２．０）为洗脱液； 采用紫外检测器（２２０ｒｉｍ），有效消除了分析中的干扰，可使柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸等有机酸及脯氨酸进行有效 分离。该方法为抗碱植物体内有机酸组分和脯氨酸的分析提供了重要的研究手段。 【关键词】有机酸；脯氨酸；高压液相色谱法 ［中图分类号】０６５２．６３ 【收稿日期】２００９—１２．０６ 【文献标识码］Ａ ［文章编号】１６７４．３２８８（２０１０）０１。００９０．０４ ［基金项目】吉林省科技厅项目（２００９０５６８）；２００９年吉林省高校重大攻关项目；吉林省教育厅项目（吉教科合字２００８ 第２７０号） 【作者简介】郭立泉（１９７１一），女，吉林工商学院生物工程分院副教授，博士，研究方向：生物学。 自从石德成等提出碱胁迫的概念以来，有关碱胁迫对植物的生理作用日益受到人们的重视。川近年来的 研究表明：在碱胁迫条件下，抗碱植物星星草体内出现有机酸特异性积累的现象，但是对其体内积累有机酸 种类和数量较少有人研究。 ・ 关于植物体内有机酸测定方法虽然已有一些报道，但仍有诸多不足。滴定法是分析检测中的一种经典 方法，它具有廉价，重复性好等优点；但灵敏度低，操作较繁琐、耗时。 比色法廉价，灵敏度高，但重复性较差。 气相色谱法灵敏度高，但前处理过程复杂，需要长时间的衍生化过程，而且反应往往不完全，使得回收率偏 低。 离子色谱法可以同时测定溶液中的有机酸根离子和无机阴离子，ｎ圳但无机阴离子的存在干扰了有机酸 的检测。相对而言，高压液相色谱法分析一些小分子有机酸具有灵敏高、重复性好、操作简便等优点，利用高 压液相色谱法测定有机酸不需要衍生化，比气相色谱法简单。“ 州但一个普遍存在的问题是，分离过程中极 易受植物体内和前处理过程中存在的硝酸根和硫酸根等无机酸的干扰；“ 还存在ｐＨ、流动相的选择等方面的 问题，尤其是在测定多种有机酸时更为明显。 本文采用反相液相色谱法，使用Ｃ１８柱；以０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍｍｏｌ・Ｌ一１四丁基硫酸氢铵（ＴＢＡ）（ｐＨ ２．０）为洗脱液；采用紫外检测器（２２０ｎｍ），有效消除了分析中的干扰，可使柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸等有 机酸及脯氨酸同时进行了有效分离。该方法为高抗碱植物体内有机酸组分和脯氨酸的分析提供了重要的研 究手段。 一、材料和方法 （一）材料的培养与前处理 以Ｉ：Ｉ的摩尔比分别将两种中性盐ＮａＣＩ和Ｎａ ＳＯ 混合作为盐胁迫组（Ａ组１２０ｍｍｏｌ・Ｌ—Ｉ ｐＨ６．７８）， 将两种碱性盐ＮａＨＣＯ，和Ｎａ２ＣＯ，混合作为碱胁迫组（Ｂ组１２０ｍｍｏｌ・Ｌ。ｐＨ ９．８ １）。将砂培法培养８周的星 星草幼苗分别用上述溶液进行透灌，每晚进行处理，每次５００ｍＬ，分３次透灌，使植株完全处于胁迫状态。 叶片或根系洗净吸表面水分后，称取鲜重１．０ ｇ，加５ｍｌ ０．５ｍｏｌ ＨＣＩ和少量石英砂充分研磨成匀浆，匀 浆液倒人试管中，在沸水浴中加热１５～２０ｒａｉｎ，中间摇动几次，冷却后加入５ｍＬ蒸馏水静置过夜。次日将匀 ・９０・ 浆液于２０００ｒ－ｍｉｎ 条件下离心，取上清液定容至２０ｍＬ，取２ｍＬ过微孔滤膜（水系、孔径０．４５ｐｍ）后进样 检测。 （二）色谱分析 １．仪器与试剂 ＳＩＭＡＤＺＵ高压液相色谱仪（日本岛津）；ＬＣ．１０ＡＴ高效液相色谱泵；岛津ＲＩＤ－１０Ａ型紫外检测器； ＳＣＬ一１０Ａ型数据处理装置。ＳＣＪ．ＴＤＺ５型离心机，ＰＨＳ一３Ｃ型酸度计。ＫＱ一２５０ＤＢ型超声波发生器。柠檬酸、 草酸、苹果酸、琥珀酸及脯氨酸等标准样品均为色谱纯，Ｌ．苹果酸为ｓｉｇｍａ公司生产。四丁基硫酸氢铵（ＴＢＡ） Ｆｌｕｋａ公司生产，过有机系滤膜后使用，水为超纯水。 ２．色谱条件 Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍｘ５ｐｍ）日本岛津仪器有限公司。流动相为０．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５ ｍｍｏｌ・ Ｌ—Ｉ ＴＢＡ水溶液（ｐＨ ２．０），流动相于超声波发生器上脱气处理２０ｍｉｎ，紫外检测波长为２２０ｎｍ，柱温４０￣Ｃ；柱 压２．０ＭＰａ，进样量５１ａｌ，流速０．５ｍｌ・ｍｉｎ。。。 ３．标准溶液的配制 分别称取草酸、苹果酸、柠檬酸、脯氨酸各５００ｍｇ，用超纯水溶解并定容至１ ００ｍＬ，然后分别吸取上述各 溶液１０ｍＬ，加入５ｍＬ ０．５ｍｏｌ・Ｌ～ＨＣ１，置于ＩＯ０￣Ｃ水浴２０ｍｉｎ，冷却后用纯水定容至２０ｍＬ，用一次性吸管吸 取上述各标准溶液２ｍｌ过微孔滤膜（水系，０．４５ｐｍ）后进样测定。 ４．组分含量的计算 响应值＝标准样品峰面积（ａｒｅａ）／一次进样相当标准样的毫摩尔数（ｍｍｏ１） 组分含量（ｍｍｏｌ／ｇ ＦＷ）：样品的峰面积／响应值／进样体积（ｍ１）×样品总体积（ｍ１）／样品重量（ｇ） （三）数据处理 数据处理及方差等统计学分析均用统计学程序ＳＰＳＳ完成，文中所有数据均以三次重复的平均值及其标 准误差（Ｓ．Ｅ）表示。检验水平为５％。 二、结果与讨论 （一）流动相的选择 在有机酸ＲＰ．ＨＰＬＣ测定法中，流动相浓度、流速和ｐＨ是影响有机酸分离和测定的３个主要因素。“ Ｌｅｂｅ￣曾报道采用Ｃ１８柱，以５ｍｍｏｌ・Ｌ～ＴＢＡ，０．５％ＫＨ２ＰＯ４作为流动相可有效分离有机酸。” 怛我们采 用相同条件时发现无法将５种有机酸进行有效地分离，经多次实验发现当ＴＢＡ质量分数为０．５ｍｍｏｌ・Ｌ 时，５种有机物分离效果明显。故选用流动相为０．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５ ｍｍｏ｜・Ｌ ＴＢＡ水溶液（ｐＨ ２．０ ｏ流速 对各组分的保留时间和峰形有明显的影响，考虑到各组分色谱峰的分离度和样品分析时间，以０．５ ｍＬ・ｍｉｎ。 的流速最好。ｐＨ对有机酸在流动相中的解离度有影响。因为在较低的ｐＨ值有利于有机酸的分离，但酸度 过低会影响色谱柱的使用寿命，因此最后选定流动相为ｐＨ值为２．０。 （二）ＨＰＬＣ法测定有机酸方法的精密度和检测范围 最终选定有机酸ＨＰＬＣ法测定条件：色谱柱为Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｃ １ ８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍｘ５ｐｍ）；流动相为０．５％ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ ２．０；流速为０．５ｍｌ・ｍｉｎ一１；进样量５ｕｌ；检测波长为２２０ｎｍ；柱温４０￣Ｃ。在上述测定条件下，得 到有机酸及脯氨酸混合标样色谱图（见图１）、混合标样保留时间、峰面积及响应值（见表１）。 １．混合标样的测定 ￡｝ｏｆ矗泣２０ ｛ｆ＂ｌ 图１ 混合标样色谱图 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄｐｒｏｌｉｎｅ １．ｐｒｏｌｉｎｅ；２．ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ；３．ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ；４．ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；５．ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：Ｏ．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５ ｍｍｏｌ。Ｌ一１ ＴＢＡ（ＰＨ ２．０）；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．５ｍｌ・ｍｉｎＬ一１；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２２０ｎｍ； ｍａｓｓ：５ｕｌ；Ｔ：４０℃． ・９１・ 表１ 混合标样保留时间、峰面积及晌应值 Ｔａｂ．１ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｐｅａｋ ａｒｅａ ｏｆｍｉｘｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅｓ ２．标准样品线性关系和精密度的测定 用各浓度混合标准样品（浓度范围为０～２００ｍｍｏｌ・Ｌ ）进行测定，各组分均得到良好分离。以样品质 量分数为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到各有机酸的线性回归方程，其线性相关系数ｒ＞０．９９。在上述测定 条件下，各有机酸的检测限和线性范围见表２。 表２标准样品的线性关系和精密度（ｎ＝５） Ｔａｂ．２ Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（ｎ＝５） （三）实验样品的分离色谱图 １．盐胁迫下，星星草茎叶中有机酸和脯氨酸色谱图（见图２） 图２盐胁迫下。星星草茎叶中有机酸和脯氨酸色谱图 Ｆｉｇ．２ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ Ｐ．ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ ｓｈｏｏｔｓ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ １．ｐｒｏｌｉｎｅ；２．ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ；３．ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ； ４．ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ：Ｏ．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５ｍｍｏｌ・Ｌ一１ ＴＢＡ（ＰＨ２．０）；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．５ｍｌ。ｍｉｎＬ－ｌ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ： ２２０ｎｍ；ｍａｓｓ：５ｕｌ；Ｔ：４０℃． ２．碱胁迫下，星星草茎叶中有机酸和脯氨酸色谱图（见图３） 图３碱胁迫下。星星草茎叶中有机酸和脯氨酸色谱图 ・９２・ Ｆｉｇ．３ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ Ｐ．ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ ｓｈｏｏｔｓ ｕｎｄｅｒ ａｌｋａｌｉ ｓｔｒｅｓｓ １．ｐｒｏｌｉｎｅ；２．ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ；３．ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ；４．ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；５．ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ：０．５％ＫＨ２ＰＯ４，０．５ ｍｍｏｌ・Ｌ－１ ＴＢＡ（ＰＨ ２．０）；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．５ｍｌ‘ｍｉｎＬ－１；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２２０ｎｍ； ｍａｓｓ：５ｕｌ：Ｔ：４０ ． ３．碱胁迫下，星星草根系有机酸和脯氨酸色谱图（见图４） ０．０５０ 卫 宝Ｏ．０２５ Ｏ．ｏｏＯ ２ ４ ６ ８ 图４碱胁迫下。星星草根系有机酸和脯氨酸色谱图 Ｆｉｇ．４ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ Ｐ．ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ ｒｏｏｔｓ ｕｎｄｅｒ ａｌｋａｌｉ ｓｔｒｅｓｓ １．ｐｒｏｌｉｎｅ；２．ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ；３．ｏｘａｌｉｃ ａｃｉｄ；４．ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；５．ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ：Ｏ．５％ＫＨ２ＰＯ４。０．５ｍｍｏｌ・Ｌ－１ ＴＢＡ（ＰＨ２．０）；ｆｌｏｗ ｒａｔｄ＂：Ｏ．５ｍｌ。ｍｉｎＬ一１；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２２０ｎｍ； ｍａｓｓ：５ｕｌ；Ｔ：４０℃． 三、结论 通过高压液相色谱法同步分析抗碱植物体内的有机酸组分和脯氨酸的研究表明，采用反相液相色谱法 （ＲＰ．ＨＰＬＣ）。使用Ｃ１８柱；以０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍｍｏｌ・Ｌ 四丁基硫酸氢铵（ＴＢＡ）（ｐＨ ２．０）为洗脱液；采用 紫外检测器（２２０ｎｍ），消除了分析中的干扰，可使柠檬酸、苹果酸、草酸等有机酸及脯氨酸进行有效分离。 结果表明该方法灵敏度高、重复性好、运行费用低、操作简便，可以用于各种生物材料、食品、饮料等产品 中的有机酸组分和脯氨酸含量的同时检测。该方法为抗碱植物体内有机酸组分和脯氨酸的同步分析提供了 重要的研究手段。 ［参考文献】 …ｌ石德成，殷立娟．盐（ＮａＣＩ）与碱（Ｎａ２ＣＯ３）对星星草胁迫作用的差异【Ｊ】．植物学报，１９９３，３５（２）：１４４－１４９． 【２石德成，２］殷立娟．Ｎａ２ＣＯ３胁迫下羊草苗的胁变反应及其数学分析【Ｊ］．植物学报，１９９２，３４（５）：３８６．３９３． 【３】ＹＡＮ Ｈ，ＺＨＡＯ Ｗ，ＪＩＡＯ Ｘ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄｓ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ｋｏｃｈｉａ Ｓｃｏｐａｒｉａ Ｓｈｏｏｔｓ ｎａｄ Ｒｏｏｔｓ ｂｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ— ｐｈａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｕｎｄｅｒ Ｓａｌｔ ｎａｄ Ａｌｋａｌｉ Ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕ．２００６，２２（３）：３ １ ５—３ １ ８． 【４】ＬＤＰＥＺ－ＭＩＬＬＡＮＡＦ，ＭＯＲＡＬＥＳＦ，ＡＮＤＡＬＵＺＳ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｓｕｇａｒｂｅｅｔ ｒｏｏｔｓｔｏｉｒｏｎ ｄｅｆｉｉｅｎｃｙ．Ｃｈａｎｇｅｓｉｎ ｃａｒｂｏｎ ａｓ－ ｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｎａｄ ｏｘｙｇｅｎ ｕｓｅ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，２０００，１２４：８８５・８９８． 【５】ＢＲＡＹ Ｅ Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，１９９３，１０３：１０３５－１０４０． 【６】ＷＡＴＴ Ｍ，ＥＶＡＮＳ Ｊ Ｒ．Ｌｉｎｋｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｙ ｗｉｔｈ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ｅｆｌｆｕｘ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｏｉｄ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ｌｕｐｉｎ ｒｇｏｗｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ ａｍｂｉｅｎｔ ｏｆｅｌｅｖａｔｅｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ＣＯ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．，１９９９，１２０：７０５－７１６． 【７】沈宏，严小龙，郑少玲，等．菜豆有机酸和无机阴离子同时分析的离子色谱法【Ｊ】．华中农业大学学报，２００１，２２（２）：８．１Ｏ． ［８郜志峰，傅承光．８］单柱离子色谱同时分析有机酸和无机阴离子的研究［Ｊ］．分析测试学报，１９９４，１３（５）：３２．３６． 【９】宋强，刘克纳，沈冬青等．有机酸与无机阴离子的梯度离子色普法分析研究［Ｊ】．色谱，１９９７，１５（４）：３３４．３３７． 【ｌＯ］鲁如坤．土壤农业化学分析方法【Ｍ】．北京：中国农业科技出版社，１９９９：４６３－４７３． 【１１】赵景婵，郭治安，常建华，等．有机酸类化合物的反相高效液相色普法的分离条件研究【Ｊ］．色谱，２００１，１９（３）：２６０．２６３． 【１２】ＬＡＲＳＥＮ Ｐ Ｂ，ＤＥＧＥＮＨＡＲＤＴ Ｊ，ＴＡＩ Ｃ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｌｕｍｉｎｕｍ．ｒｅｓｉｓｔｎａｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｔｈａｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｌｔｅｒｅｄ ｐａｕｅｍｓ ｏｆａｌｕｍ． ｉｎｕｍ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ【Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１ ９９８，１ １ ７：９－１ ７． 【１３］达世禄．色谱学导论［Ｍ］．武汉：武汉大学出版社，１９９９：１２．３６． ［１４】ＢＨＡＳＫＡＲＮ Ｓ，ＳＭＩＴＨ Ｒ Ｈ，ＮＥＷＴＯＮＭ Ｒ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｏｒｇｈｕｍ ｃｅｌｌ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗａｔｅｒ ｓ￣ｅｓｓ １．Ｆｒｅｅ ｐｒｏｌｉｎｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｏｉｌ，１ ９８５，７９：２６６—２６９． ［１５】ＬＩＢＥＲＴ Ｂ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ［Ｍ］．１９８１，２１０：５４０－５４３． ［责任编辑：王少林】 ・９３・