HPLC同时测定何首乌中5种成分及指纹图谱的建立

HPLC同时测定何首乌中5种成分及指纹图谱的建立

王珏1，朱育凤2，姚毅2，金超3，邱明鸣2，刘史佳2

1.中国药科大学，江苏 南京 210009；2.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；

3.南京中医药大学，江苏 南京 210023

摘要：目的 建立HPLC同时测定不同产地何首乌中5种指标性成分含量的方法，并建立何首乌HPLC指纹图谱分析方法。方法 采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，测定何首乌样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚含量，用SPSS19.0统计软件对数据进行聚类分析，建立何首乌HPLC指纹图谱并进行分析。结果 何首乌中5种指标性成分的进样量在线性范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 4。安徽阜阳样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素甲醚含量最高（分别为0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%），贵州安顺样品中大黄素含量最高（0.423 8%）；安徽阜阳样品中指标成分平均总含量最高（3.966 6%），其次为安徽亳州（2.769 8%）、贵州（2.469 4%）及四川（2.306 3%）。云南何首乌样品与其他产地的指纹图谱差异较大，且二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚成分未检出。14批样品指纹图谱有18个共有峰，指认了2、4、7、17、18号峰分别为五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚。结论 本试验建立的方法稳定可靠，重现性好，能有效用于何首乌的质量控制。 关键词：何首乌；含量测定；指纹图谱；聚类分析

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)06-0075-07 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.06.016

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Determination of Five Components in Polygoni Multiflori Radix by HPLC

and Establishment of Fingerprints

WANG Jue1, ZHU Yufeng2, YAO Yi2, JIN Chao3, QIU Mingming2, LIU Shijia2

1. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese

Medicine, Nangjing 210029, China; 3. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China Abstract: Objective To establish an HPLC method to determine the contents of five kinds of index components in Polygoni Multiflori Radix from different producing areas; To establish HPLC fingerprint analysis method of Polygoni Multiflori Radix. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used, with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase, gradient elution, to determine the contents of galloyl glucose, gallic acid, stilbene glycoside, emodin, and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix, and SPSS19.0 software was used to conduct clustering analysis for the data. HPLC fingerprints of Polygoni Multiflori Radix were established and analyzed. Results The injection volume of five index components of Polygoni Multiflori Radix showed a good linear relationship with the peak area integral value in the linear range, and the correlation coefficient were all higher than 0.999 4. The results of the content determination showed that the contents of galloyl glucose, gallic acid, stilbene glycoside, and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix from Fuyang, Anhui Province was the highest (0.048 9%, 0.036 1%, 3.179 9%, 0.551 2%, respectively), and the content of emodin of Polygoni Multiflori Radix from Anshun, Guizhou Province was the highest (0.423 8%). The average total content of index components of sample from Fuyang, Anhui Province was the highest (3.966 6%), followed by samples from Bozhou, Anhui Province (2.769 8%), Guizhou Province (2.469 4%) and Sichuan Province (2.306 3%). The fingerprints

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81774096）；江苏省自然科学基金面上项目（BK20161610）；江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目（WSN-051）；江苏省青年医学人才项目（QNRC2016642）；江苏省中医药局科技项目（YB2017025） 通讯作者：刘史佳，E-mail：liushijia2011@163.com

·76· Chinese Journal of Information on TCM Jun.2019 Vol.26 No.6

of Polygoni Multiflori Radix samples from Yunnan Province were quite different from other producing areas, and stilbene glycoside, emodin, and emodin methyl ether were not detected. There were 18 common peaks in the fingerprints of 14 batches of samples, and the peak 2, 4, 7, 17, and 18 were determined to be galloyl glucose, gallic acid, stilbene glycosides, emodin, and emodin methyl ether. Conclusion The method established by the experiment is stable, reliable, and reproducible, and can be effectively applied to the quality control of Polygoni Multiflori Radix. Keywords: Polygoni Multiflori Radix; content determination; fingerprints; clustering analysis

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便功效，用于疮痈、风疹瘙痒、久疟体虚、肠燥便秘等[1]。目前市售何首乌存在伪品、掺伪、染色等问题，影响何首乌的临床应用[2]，因此，制定相应的质量控制标准十分关键。何首乌主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类等化合物[3-11]。本研究以二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、五没食子酰葡萄糖、没食子酸为指标成分，采用HPLC对不同产地的何首乌样品进行含量测定，比较不同产地何首乌之间的差异，并建立HPLC指纹图谱分析方法，为江苏省中医院何首乌药材基地进行标准化、规范化种植与加工提供数据支持，为药监部门对何首乌进行质量监控提供参考方法，并为2020年版《中华人民共和国药典》何首乌质量标准的修订提供参考。 1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪（G4212B型二极管阵列检测器，G1312B型二元泵，G1367E型高性能自动进样器，G1322A型脱气机，G1316A型柱温箱），BP211D型精密电子分析天平（德国Sartorius公司），OHAUS AX224ZH/E型电子分析天平（苏州赛恩斯仪器有限公司），KQ-6200H型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

没食子酸（批号141109）、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷（二苯乙烯苷，批号16081506）、大黄素（批号151008）、大黄素甲醚（批号17022010），成都普菲德生物技术有限公司有限公司，纯度≥98%；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（五没食子酰葡萄糖，批号lw16041905，纯度≥98%），南京良玮生物科技有限公司；大黄酚（批号c1724029）、芦荟大黄素（批号380041）、大黄酸（批号951089），北京百灵威科技有限公司，纯度≥98%。甲醇、乙腈为色谱纯，德国默克试剂有限公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

何首乌样品由安徽井泉中药饮片有限公司、安徽万生中药饮片有限公司、贵州同德药业中药饮片有限公司、安徽协和成药业中药饮片有限公司帮助收集，

经南京中医药大学附属医院朱育凤主任中药师鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，见表1。

表1 不同产地何首乌样品来源信息

编号产地 批号 提供单位

1 贵州松桃20171129贵州同德药业中药饮片有限公司 2 贵州安顺20171027贵州同德药业中药饮片有限公司 3 贵州从江20170103贵州同德药业中药饮片有限公司 4 贵州松桃20151130贵州同德药业中药饮片有限公司 5 贵州松桃20151207贵州同德药业中药饮片有限公司 6 贵州安顺20160120贵州同德药业中药饮片有限公司 7 贵州从江20171130贵州同德药业中药饮片有限公司 8 贵州都匀20180130贵州同德药业中药饮片有限公司 9 贵州毕节

20171012

安徽万生中药饮片有限公司 10 四川 20171020安徽万生中药饮片有限公司 11 云南 20171024安徽万生中药饮片有限公司 12 安徽阜阳

20171030

安徽万生中药饮片有限公司 13 贵州 20171012安徽井泉中药饮片有限公司 14 四川 20171020安徽井泉中药饮片有限公司 15 云南 20171024安徽井泉中药饮片有限公司 16

安徽亳州

20180115

安徽协和成药业中药饮片有限公司

注：1、2、3、12、16号于各公司种植基地收样，其余均购自药材市场

2 方法与结果 2.1 指标成分含量测定 2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液；按表2程序进行梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

表2 流动相梯度洗脱程序（%）

时间 0.1%磷酸 乙腈 0 min 90.0 10.0 10 min 80.0 20.0 15 min 70.0 30.0 30 min 55.0 45.0 35 min 20.0 80.0 40 min 10.0 90.0 100 min

90.0

10.0

2019年6月第26卷第6期 中国中医药信息杂志 ·77·

2.1.2 混合对照品溶液的制备

分别取适量没食子酸、五没食子酰葡萄糖、大黄素、二苯乙烯苷（避光）、大黄素甲醚对照品，加适量甲醇溶解，制成浓度分别为1.26、1.91、1.98、5.21、1.96 mg/mL的对照品贮备液。 2.1.3 供试品溶液的制备

取何首乌细粉（过80目筛）约2.0 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入90%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声提取（功率280 W，频率50 Hz）45 min，五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚RSD分别为3.66%、4.71%、2.00%、0.60%、0.35%，表明本方法重复性良好。 2.1.8 加样回收率试验

精密称取9号样品1.0 g，共6份，加入五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，测得各成分平均加样回收率分别为101.46%、103.64%、103.64%、放冷，称重，补足减失的质量，过滤，取续滤液，过0.20 μm微孔滤膜，即得。 2.1.4 线性关系考察

取“2.1.2”项下对照品贮备液适量，混合后，等比逐级稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，计算回归方程，结果见表3。各成分相关系数均大于0.999 4，在相应的范围内线性关系良好。

表3 何首乌中5种指标成分线性关系考察结果 对照品

回归方程

相关系数 线性范围/μg 五没食子酰葡萄糖 Y＝11.651X－2.572 6 0.999 4 0.018 6～1.293 8 没食子酸 Y＝10.658X－7.365 3 0.999 9 0.040 2～2.575 0 二苯乙烯苷 Y＝4.839X＋66.807 0.999 7 0.204 8～102.400 0大黄素 Y＝14.891X－37.376

0.999 5

0.155 6～19.900 0

大黄素甲醚

Y＝5.649X－105.99 0.999 6 0.611 0～20.950 0

2.1.5 精密度试验

精密吸取“2.1.2”项下对照品贮备液适量，混合后，按“2.1.1”项下色谱条件，连续进样6次，每次20 μL，记录色谱图。以峰面积计，五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为2.48%、4.75%、4.31%、1.59%、0.63%，表明仪器精密度良好。 2.1.6 稳定性试验

精密称取9号样品2.0 g，按“2.1.3”项下方法处理，避光、室温放置，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，以峰面积计，五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为3.71%、4.26%、1.99%、0.34%、0.43%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。 2.1.7 重复性试验

精密称取9号样品6份，按“2.1.3”项下方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以峰面积计，

96.52%、100.45%，RSD分别为0.55%、0.18%、0.42%、0.55%、0.89%，见表4。

表4 何首乌中5种指标成分加样回收率试验结果

平均样品

平均加

平均测

平均加样

RSD 成分

含量/μg

入量/μg 得量/μg 回收率/%/% 五没食子酰葡萄糖 13.34 62.02 76.24 101.46 0.55 没食子酸

10.53

379.94 407.90

103.64

0.18

二苯乙烯苷 775.48 1338.11 2162.29 104.57 0.42 大黄素 87.13 249.89 241.30 96.52 0.55 大黄素甲醚

135.46

392.08 529.11

100.45

0.89

2.1.9 样品含量测定

取16批何首乌样品各约2.0 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算指标成分含量，结果见表5，色谱图见图1。

表5 何首乌样品中5种指标成分含量测定结果（%）

编号五没食子酰葡萄糖没食子酸 二苯乙烯苷 大黄素大黄素甲醚 1 0.026 8 0.008 8 1.529 5 0.194 50.295 3 2 0.044 1 0.018 9 2.527 2 0.423 80.521 6 3 0.020 1 0.003 4 2.915 8 0.083 50.384 6 4 0.045 9 0.016 7 2.209 4 0.409 00.503 3 5 0.024 7 0.018 1 1.166 3 0.298 90.466 0 6 0.028 3 0.020 8 1.411 5 0.199 00.299 8 7 0.027 6 0.021 5 1.597 9 0.184 50.336 8 8 0.021 5 0.014 5 2.157 9 0.050 30.268 9 9 0.023 8 0.023 5 1.519 2 0.240 30.366 8 10 0.018 5 0.017 4 1.147 8 0.106 50.193 6 11 0.016 7 0.013 7 － － － 12 0.048 0 0.036 1 3.179 9 0.151 40.551 2 13 0.025 2 0.022 1 1.100 4 0.254 50.321 4 14 0.020 5 0.014 6 2.780 6 0.086 80.226 3 15 0.033 4 0.032 5 － － － 16

0.023 2

0.016 2

2.211 6

0.108 7

0.410 1

注：“－”为未检出

·78· Chinese Joournal of Information on TCM Juun.2019 Vol.26 No.6 4 2 7 8 5 1 3 66 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 AA 3 7 8 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 BB 5 10 15 20 25 30 35 40 45 CC t/miin 注：A.对照照品；B.供试品（7号）；C.供试品品（11号）； 1.五没食子酰葡萄萄糖；2.没食子酸酸；3.二苯乙烯苷；4.芦荟大黄素； 5.大黄酸；6.甲苯；7.大黄素素；8.大黄酚；9.大黄素甲醚大 图1 何首乌中5种成分HPLC图 2.22 不同产地地何首乌聚类分分析 采用SPSSS19.0软件进进行系统聚类类分析，以4个不同省份何首乌乌样品中的5种指标成分分为研究对象象。将原原始数据经标标准化变换后后，采用平方方Euclidean距离法计算样品间的相似性性，选用组间间距离法进行行聚类，结果见图2。可以看出出，云南何首首乌样品距离离最远，其次为安徽徽样品，四川川与贵州样品品聚为一类。 0 5 10 15 20 2 25 贵州 四川 安徽 云南 图2 不同同产地何首乌样品品指标成分含量聚聚类分析图 2.33 何首乌指指纹图谱的建立立 2.33.1 样品来源源 因云南产地何首乌样品中未检测测出二苯乙烯烯苷类及蒽蒽醌类成分，不符合药典典规定，其峰峰型与其他产产地的何何首乌样品存存在显著差异异，故采用其其余14批样样品建立立何首乌指纹纹图谱。样品品来源信息见见表6。 表6 何首乌指纹图谱谱样品来源信息 编号产地 批号 编编号 产地 批号 S1贵州松桃 20171129 SS8 贵州都匀匀 20180130S2贵州安顺 20171027 SS9 贵州毕节节 20171012S3贵州从江 20170103 SS10 四川 20171020S4贵州松桃 20151130 SS11 安徽阜阳阳 20171030S5贵州松桃 20151207 SS12 贵州 20171012S6贵州安顺 20160120 SS13 四川 20171020S7贵州从江 20171130 SS14 安徽亳州州 201801152.3.2 色谱条件 同同“2.1.1”项项下色谱条件件。 2.3.3 供试品溶液液的制备 按“按2.1.3”项项下方法制备备供试品溶液液。 2.3.4 参照峰的选选择 在指纹图谱中在中，二苯乙烯烯苷分离度较较好，峰面积积大，是是何首乌的主主要活性成分分，具有肝脏脏保护、神经经保护、、抗氧化清除除自由基作用用、抗肿瘤等等作用[12]，因此选择择二苯乙烯苷苷峰作为参照照峰。 2.3.5 精密度试验验 取何首乌样品取品（S9）2.0 gg，精密称定，按“2.1.3”项下方方法制备供试试品溶液，避避光、室温放置置，按“2.1.1”项下色色谱条件连续续进样6次，记录色谱峰峰面积，以二二苯乙烯烯苷为参照峰峰计算各共有峰的相对峰面积，其其RSD均小于4.36%%。采用《中中药色谱指纹纹图谱相似度度评价系系统（2012版）版》进行分分析，各样品品色谱图之间的相似似度为1，符符合指纹图谱谱技术要求。 2.3.6 稳定性试验验 取何首乌样品取品（S9）2.0 gg，精密称定，按“2.1.3”项下方方法制备供试试品溶液，避避光、室温放置置，按“2.1.1”项下色色谱条件，分分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，记记录色谱峰面面积，计算各各共有峰的相相对峰面积，其RSSD均小于4..71%。采用《《中药色谱指指纹图谱相似似度评价价系统（20112版）》软件件进行分析，各样品色谱谱图之间间的相似度为为1，表明供供试品溶液在12 h内稳定定性良好好。 2.3.7 指纹图谱建建立及相似度度评价 取14批何首首乌样品粉末末，按“2.1.33”项下方法法制备供供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条条件测定，记记录色谱谱图，导入《《中药色谱指指纹图谱相似似度评价系统统（20112版）》软件件进行分析。以S1样品图图谱作为参照照2019年6月第26卷第卷6期 中国中医药药信息杂志 ·79· 图谱，采用多点校正方法法匹配色谱图图，通过中位位数法生成对照图图谱，共确定了18个共有有峰。采用对对照品对照，确定定了2、4、7、17、18号峰峰分别为五没没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、、大黄素、大大黄素、4）。采用中位数法导导出14份样样品甲醚（见图3、图相似度评价（见表7、表8）的共有模式与的。14份样样品中有11份相似似度大于0.900，质量相对稳定；其中S9S、S110、S12相似似度低于0.900，质量稍差差。 4 172 7 18 5 10 15 20 2 25 30 35 40 45 t/min 注2.五没食子酰葡注：葡萄糖；4.没食子子酸；7.二苯乙烯苷；17.大黄素；18.大黄素甲醚（（下同） 图3 混合对照品品图谱 7 172 4 18 R RS14 SS13 SS12 SS11 SS10 SS9 SS8 SS7 SS6 SS5 SS4 SS3 SS2 SS1 S 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 344 46 48 50 t/min 图4 14批何首乌样品HPLCH指纹图谱 表7 14批何首首乌样品指纹图谱谱共有峰相对峰面面积 峰号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9S10 S11 S12 S13 S144 00.13 0.10 0.08 0.11 0.17 00.16 0.12 0.08 0.155 0.15 0.10 0.29 0.07 0.099 00.04 0.04 0.03 0.05 0.05 00.05 0.04 0.02 0.044 0.04 0.04 0.05 0.02 0.022 00.06 0.07 6 0.23 00.13 0.09 0.07 0.099 0.01 0.04 0.30 0.05 0.044 0.01 0.0600.01 0.02 0.01 0.022 0.03 00.03 0.03 0.01 0.033 0.03 0.02 0.04 0.01 0.022 00.05 0.07 0.06 0.066 0.11 00.11 0.11 0.09 0.100 0.16 0.19 0.17 0.08 0.133 00.04 0.04 0.06 0.05 0.09 00.10 0.08 0.07 0.088 0.17 0.11 0.07 0.09 0.088 1.11 0.93 1.04 1.11 1.19 11.19 1.13 0.93 0.244 1.29 1.22 0.27 0.89 1.088 1.00 1.00 1.00 1.000 1.00 11.00 1.00 1.00 1.000 1.00 1.00 1.00 1.00 1.000 00.15 0.11 0.15 0.15 0.14 00.13 0.16 0.17 0.188 0.20 0.22 0.15 0.11 0.177 00.32 0.28 0.77 0.777 0.17 00.27 0.30 0.31 0.377 0.59 0.60 0.21 0.35 0.533 00.05 0.09 0.06 0.066 0.05 00.06 0.06 0.07 0.144 0.17 0.11 0.06 0.10 0.077 00.22 0.35 0.16 0.166 0.16 00.24 0.22 0.28 0.366 0.33 0.44 0.25 0.41 0.31 00.08 0.17 0.14 0.144 0.08 00.10 0.10 0.12 0.422 0.27 0.23 0.27 0.18 0.199 00.08 0.13 0.04 0.044 0.07 00.09 0.06 0.07 0.188 0.14 0.07 0.07 0.11 0.033 00.05 0.05 0.03 0.03 0.05 00.06 0.05 0.05 0.133 0.08 0.05 0.05 0.06 0.022 00.01 0.04 0.01 0.01 0.01 00.02 0.01 0.01 0.022 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 00.38 0.51 0.08 0.08 0.77 00.42 0.35 0.07 0.488 0.27 0.14 0.69 0.09 0.155 00.20 0.23 0.14 0.144 0.44 00.23 0.23 0.13 0.266 0.17 0.19 0.31 0.08 0.200 ·80· Chinese Journal of Information on TCM Jun.2019 Vol.26 No.6

表8 14批何首乌样品指纹图谱相似度计算结果

编号 S1 S1 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 R S1 S2

1.000 0.914

1.000

S3 0.868 0.822 1.000 S4 0.917 0.997 0.828 1.000 S5 0.943 0.900 0.783 0.901 1.000 S6 0.970 0.878 0.837 0.881 0.955 1.000S7 0.966 0.866 0.853 0.869 0.935 0.991S8 0.955 0.876 0.893 0.874 0.880 0.950S9 0.690 0.699 0.611 0.682 0.664 0.687S10 0.600 0.459 0.587 0.472 0.505 0.655S11 0.882 0.742 0.795 0.750 0.760 0.877S12 0.732 0.727 0.587 0.707 0.752 0.749S13 0.918 0.863 0.841 0.860 0.833 0.908S14 0.931 0.812 0.858 0.817 0.830 0.932R

0.970 0.905 0.897 0.907 0.903 0.966

1.0000.9640.6960.6780.9090.7450.9140.9500.975

1.0000.6940.6250.8930.7120.9350.9480.968

1.0000.5060.6510.9140.7860.7090.769

1.0000.7550.5060.6280.7290.714

1.0000.6740.8450.9620.928

1.000

1.000

0.700 1.000

0.731 0.905 1.0000.781 0.947 0.969

4 讨论

在流动相选择上，本试验比较了甲醇-水与乙腈-0.1%磷酸水溶液[5]，结果当流动性为乙腈-0.1%磷酸水溶液时，各成分峰形及分离度较好，故选用乙腈- 0.1 %磷酸水溶液作为流动相。

在供试品溶液制备中，本试验比较了70%、80%、90%、100%甲醇作为提取溶剂在相同环境条件下的提取效果，通过进样分析，比较各成分的峰面积，发现90%甲醇作为提取溶剂时效果最佳，故选用90%甲醇作为提取溶剂。

由指标成分含量测定结果可知，何首乌主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类，其中，蒽醌类化合物主要为大黄素和大黄素甲醚，而大黄酸、大黄酚和芦荟大黄素含量极低甚至难以测出；此外，何首乌中还含有少量五没食子酰葡萄糖、没食子酸。由表5可知，贵州、安徽、四川产地的何首乌样品中的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚含量均符合2015年版《中华人民共和国药典》规定；云南产地何首乌样品中未检测出二苯乙烯苷类及蒽醌类成分，不符合药典规定。由图1、图2可以看出，云南产地何首乌样品峰形与其他产地的何首乌样品存在显著差异，推测云南产地的何首乌可能是其同属近源物种。安徽阜阳的何首乌样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷及大黄素甲醚的含量最高（分别为0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%）；贵州的何首乌样品中大黄素含量最高（0.423 8%）。指标性成分平均总含量最高的为安徽

阜阳样品（3.966 6%），其次为安徽亳州、贵州、四川样品（2.769 8%、2.469 4%、2.306 3%）。聚类分析结果表明，不同产地何首乌之间有一定差异，云南产何首乌与其他产地样品差异显著，与含量测定结果相符；安徽产何首乌与四川、贵州样品差异也较大，四川与贵州样品接近，可归为一类，这与各地区地理位置存在一定相关性。

本试验建立了何首乌HPLC指纹图谱，确定了18个共有峰，指认了何首乌中的五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚5个化学成分。通过使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析，14批样品中有11批相似度＞0.90，S9、S10、S12相似度＜0.90，表明大部分何首乌样品质量较稳定，少数样品质量有待提高。指纹图谱的建立有助于优化何首乌的质量控制方法，可应用于何首乌的质量检测。

综上所述，本试验测定了16批不同产地的何首乌样品中五没食子酰葡萄糖、没食子酸、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚5种指标性成分的含量，通过使用SPSS19.0软件进行聚类分析，发现云南产何首乌样品为同属近源种，不能作为何首乌药材使用，且何首乌指标成分含量的分布具有一定地域性。本试验采用贵州、四川、安徽何首乌样品建立了何首乌HPLC指纹图谱，确定了18个共有峰，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件分析发现，14批样品中有3批样品质量稍差。本研究建立的指纹图谱能够较全面

2019年6月第26卷第6期 中国中医药信息杂志 ·81·

反映何首乌的整体情况。将指标成分含量测定结果与指纹图谱结合，能较完整地体现何首乌的质量。方法学考察结果表明，本方法稳定、可靠，重现性好，可作为何首乌质量控制的检测方法之一。本研究可为何首乌的质量控制及2020年版《中华人民共和国药典》何首乌质量标准的修订提供参考依据。

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（收稿日期：2018-08-02）（修回日期：2018-08-29；编辑：陈静）